杨 旭，吴东舒，华昕彤，李 荣，吕 伟，姜 晨

(1.大连海洋大学，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023； 2.大连富谷食品有限公司， 辽宁 大连 116400 )

红鳍东方鲀(Takifugurubripes)属硬骨鱼纲、鲀形目、鲀科、东方鲀属，生活在近海，为食肉性鱼类，大多数都生活在太平洋北部的国家，如日本、朝鲜和中国等[1]，是河鲀中经济价值较高的，可以进行人工养殖的优良品种之一[2-3]。在日、韩等国，河鲀消费量巨大，尤其是红鳍东方鲀的消费量最大。但由于养殖水域中存在的大量细菌、病毒，红鳍东方鲀养殖时常被病害困扰，弧菌病和寄生虫病最为常见[4]。其中哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是海洋微生物区系中的一员，同时也是海洋动物的致病菌之一[5-6]。鱼类在感染弧菌患病后，多数外在表现为体表溃烂，鳞片脱落，内在表现为肠道、肝脏充血、出现血斑等现象，严重时会出现大规模死亡。王斌等[7]曾报道，大连地区红鳍东方鲀皮肤溃烂病的病原菌为哈维氏弧菌；张超等[8]也有相同的发现。

哺乳动物机体的免疫系统被病原菌侵犯时，会引发防御机制从而去除异物[9]。鱼类免疫与哺乳动物相同，分为特异性和非特异性免疫，但其非特异性免疫发挥主要作用。非特异性免疫对病原体的识别是通过模式识别受体(PRR)与病原相关分子模式(PAMP)的相互结合实现，这与哺乳动物相似。但为适应水生生活，鱼类非特异性免疫对病原相关分子模式的识别范围更广，免疫应答的启动条件更低[10]。非特异性免疫的效应细胞主要是单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞等，具有吞噬和杀伤功能，还可分泌多种免疫相关的细胞因子，介导发生炎症反应。而在鱼类先天性免疫系统中，白介素、干扰素、溶菌酶等免疫因子具有重要的功能[11-12]。白细胞介素(IL)是一个与鱼类炎症反应密切相关的功能性蛋白家族，目前已发现40多种[13]，其中主要分为白介素-1(IL-1)家族、白介素-2(IL-2)家族(YC家族)、趋化因子家族、白介素-10(IL-10)家族等。Peng等[14]对红鳍东方鲀感染哈维氏弧菌后的转录组进行分析，发现红鳍东方鲀3个白介素基因IL-1b、IL-8和IL-10均呈差异表达，但并未进行试验验证，其序列特征也没有分析。IL-1b是由IL-1衍生而来的细胞因子[15-16]，多数由巨噬细胞分泌[17]。IL-1b参与免疫应答过程，能够刺激和促进一些免疫细胞如B细胞、T细胞的合成、分化，增强参与免疫反应细胞的杀伤力，介导炎症反应[18-21]。IL-8是趋化因子家族的一种细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生[22]。在免疫过程中，IL-8通过趋化免疫细胞来影响免疫细胞对抗原的识别[23]，而在抗炎过程中，IL-8则通过对中性粒细胞的趋化从而对病原起到杀伤作用[24-25]。IL-10是一种抗炎细胞因子，主要由淋巴细胞、巨噬细胞和T细胞产生[26-28]。IL-10能够调节固有免疫细胞的生长和分化[29]，并抑制T细胞的活化和功能，从而促使机体免疫应答趋于平稳[30]，起到对免疫反应负调控的作用。除此之外，IL-10还可以直接抑制黏附因子的表达[31-32]。

笔者对红鳍东方鲀3个白介素IL-1b、IL-8和IL-10基因的序列特征进行了分析，对其mRNA在不同组织中的表达情况进行了检测，并测定了哈维氏弧菌感染红鳍东方鲀后3个基因在肝脏及脾脏的表达情况，为深入探究红鳍东方鲀白介素基因的免疫作用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析

自美国国立生物技术信息中心得到IL-1b、IL-8和IL-10基因序列的全长(NM_001280090.1、NM_001032587.1、XM_003973694.3)，通过简单的模块化结构研究工具SMART和Clustal Omega进行了多序列比对分析和保守结构域、基序和信号肽的鉴定。

1.2 健康红鳍东方鲀组织的采集

试验所用红鳍东方鲀均采购于大连富谷食品有限公司，体长为(15.19±0.32) cm，平均体质量为(190.34±2.13) g，试验前暂养7 d。以15尾红鳍东方鲀为试验对象，5尾为一组，设3个平行组，进行组织采样。采集6个组织，包括脑、鳃、心脏、肌肉、肝脏和脾脏，液氮冷冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 哈维氏弧菌感染试验

试验共选取60尾红鳍东方鲀，设置3个平行组。参考前期试验结果[7]，经过预试验确定向试验组每尾红鳍东方鲀注射密度1×107cfu/mL的哈维氏弧菌0.1 mL，分别在感染0、12、24、48 h时自3个平行组中各随机挑选5尾鱼，进行红鳍东方鲀肝脏和脾脏组织采样，液氮冷冻后于冰箱-80 ℃保存，用于提取样品总RNA。

1.4 RNA的提取及反转录

取试验样品20 mg使用TIANGEN动物总RNA提取试剂盒进行RNA的提取，采用NanoDrop 2000c UV核酸定量仪进行RNA浓度检测。使用TIANGEN FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒进行反转录。

1.5 实时荧光定量PCR测定

采用Primer Premier 5.0设计IL-1b、IL-8和IL-10基因引物和内参基因β-actin的引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，通过实时荧光定量PCR法检测红鳍东方鲀中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表达情况。

混合样品试剂，使用实时荧光定量PCR分析仪(Applied Biosystems, USA)检测，设置3次重复试验。反应结束后，对相对表达量进行统计学分析。将所得结果用 2-ΔΔCt法计算分析比较，并进行单因素方差分析，用SPSS 22.0进行数据处理，以P<0.05表示差异显著，分析各组织的相对表达水平。

表1 红鳍东方鲀白介素基因实时荧光定量PCR表达分析 的引物序列

2 结 果

2.1 红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析、系统进化和同源性分析

使用SMART软件分析3个基因的保守结构域(图1a)，预测发现红鳍东方鲀IL-1b序列存在一个保守的功能域IL-1，IL-8基因包含一个SCY结构域，IL-10序列存在信号肽和一个保守的功能域IL-10。在红鳍东方鲀和其他鱼类的序列比对中，发现IL-8基因具有特殊的结合位点(图1b)，IL-10 mRNA 3′端存在特殊的TATTTATT片段。

2.2 红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因组织表达分析

通过实时荧光定量PCR法对红鳍东方鲀健康组织中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表达模式进行分析。IL-1b、IL-8和IL-10基因在所有检测组织中均有表达，IL-1b基因在脾脏中表达量最高，达到脑的41倍，另外，在肝脏和鳃中表达量也显著高于脑组织，心脏和肌肉中表达量较低。IL-8基因在脾脏、肝脏中表达量显著高于脑组织，达到脑的37倍和10倍。IL-10基因在脾脏中的表达水平最高，肝脏、肌肉中表达次之，而在鳃、心脏、脑中表达量较低(图2)。

图1 红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列分析Fig.1 Sequence analysis of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tiger puffer T. rubripes a.红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因结构域； b.不同物种IL-8基因氨基酸序列比对(红框表示ELR基序). a.domain structures of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tiger puffer T. rubripes; b.amino acid sequence alignment of IL-8 gene in different species (red frame shows the ELR motif).

图2 红鳍东方鲀健康组织样品中IL-1b、IL-8和IL-10基因的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of IL-1b, IL-8 and IL-10 genes in tissues of healthy tiger puffer T. rubripes *表示与脑组织的表达量相比有显著性差异. * indicates significant differences compared to brain tissue.

2.3 红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因在哈维氏弧菌感染后的表达分析

采用实时荧光定量PCR法分析哈维氏弧菌感染后红鳍东方鲀肝脏和脾脏组织中的IL-1b、IL-8和IL-10基因表达情况(图3～图5)，结果表明，感染哈维氏弧菌后肝脏和脾脏中的IL-1b基因表达量均显著升高，在染菌后12 h的表达量显著高于0 h，肝脏组织在24、48 h表现出持续下降，48 h的表达量与0 h相比没有显著变化，而脾脏在24、48 h仍处于一个较高的表达量。感染哈维氏弧菌后肝脏和脾脏的IL-8基因表达量均显著升高，在染菌后12 h的表达量显著高于0 h，并于24 h之后表达下降但依旧有差异，在48 h的表达量与0 h相比无显著变化。感染哈维氏弧菌后肝脏和脾脏中的IL-10基因表达量均显著升高，肝脏中12 h表达量升高但无显著差异，24 h显著高于0 h的表达量，48 h开始下降但是仍差异显著。脾脏中12 h表达量显著高于0 h，于24 h有一定的下降，48 h表达量又显著增加达到峰值。

图3 红鳍东方鲀脾脏和肝脏中IL-1b基因 在哈维氏弧菌感染后的时空表达Fig.3 Expression profiles of IL-1b gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi *表示与0 h相比有显著性差异，下同. * indicates significant differences compared with the tiger puffer in the control group, et sequentia.

图4 红鳍东方鲀脾脏和肝脏中IL-8基因 在哈维氏弧菌感染后的时空表达Fig.4 Expression profiles of IL-8 gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi

图5 红鳍东方鲀脾脏和肝脏中IL-10基因 在哈维氏弧菌感染后的时空表达Fig.5 Expression profiles of IL-10 gene in the spleen and liver of tiger puffer T. rubripes challenged with V. harveyi

3 讨 论

3.1 基因序列特征分析

通过基因结构分析发现，IL-1b的预测蛋白序列仅包含一个功能结构域，称为IL-1结构域，在斑马鱼(Daniorerio)、罗非鱼(Oreochromsmossambcus)、双斑东方鲀(T.bimoculatus)中高度保守[33]。在哺乳动物中，IL-1b转化酶(ICE)通过切割IL-1b前体，进而释放具有活性的IL-1b蛋白[34]。同时已有研究表明，在硬骨鱼中，IL-1b同样需要切割，才会具有活性。但通过序列分析并未找到IL-1b转化酶切割位点，切割机理尚不清楚[35-36]。

红鳍东方鲀IL-8蛋白在34～94位氨基酸残基间的趋化因子(CXC)结构域里存在SCY保守区域。其多肽序列中存在4个保守的半胱氨酸，在每2个半胱氨酸之间存在着1个精氨酸，这与大多数鱼CXC趋化结构一致。此外，IL-8基因在哺乳动物和鸟类等高等动物中普遍存在受体结合位点Glu-leu-Arg(ELR)基序，有研究表明，ELR基序在哺乳动物中具有诱导中性粒细胞的作用[37]。通过分析已知的鱼类IL-8氨基酸序列可知(图1b)，大头鳕(G.macrocephaus)[38]和大西洋鳕[38]中的基序为ELR，而褐牙鲆中为SLH[39]，黑线银鲛中为SLQ[40]，虹鳟中为DLR[41]，七鳃鳗(Lampetrafluviatilis)中为GGR[42]，在已发表其他鱼类中还含有9种相类似的基序：AER、LLR、SLR、DPR、EQH、AMH、EMH、ELH和QLS[43]，红鳍东方鲀中IL-8基因中的基序是EQH。研究表明，尽管目前仅有鳕鱼科鱼类发现ELR基序，其他包含类似基序的鱼类即使缺乏ELR基序也能吸引中性粒细胞[44-45]，但是趋化能力明显弱于ELR基序[46]。

红鳍东方鲀的IL-10预测蛋白中含有IL-10功能域和一个疏水前导序列。此外，在红鳍东方鲀IL-10 mRNA的3′UTR中(772 bp到779 bp)，存在一个不稳定基序TATTTATT，该基序被认为是降解因子的最佳结合位点[27]。

3.2 红鳍东方鲀各组织IL-1b、IL-8和IL-10基因表达情况

3.3 哈维氏弧菌感染后红鳍东方鲀组织中IL-1b、IL-8和IL-10基因表达的变化

为进一步研究3个基因在哈维氏弧菌感染后的表达模式，笔者通过实时荧光定量PCR对其48 h内的表达进行了分析。试验结果表明，感染初期红鳍东方鲀的肝脏中，IL-1b基因在刺激后的12 h出现明显上调并达到峰值，随后逐渐下降；脾脏中也是在初期快速表达，48 h仍处于一个较高的表达量。IL-1b可作用于肝细胞使其摄取氨基酸能力变强，进而合成和分泌大量急性期蛋白，所以IL-1b基因在短时间内大量生成。同样的现象在其他鱼类也有发现，如在虹鳟[54]中，IL-1b基因在脂多糖刺激4 h后在头肾白细胞和巨噬细胞中大量表达。小斑点猫鲨(Scyliorhinuscanicula)在注射脂多糖后，肝脏和精巢中IL-1b基因表达量在5 h明显增加[55]。虹鳟和小斑点猫鲨IL-1b基因皆是在刺激后短时间内，表达量显著增加，可见IL-1b基因在受到刺激时迅速反应且高表达。其次，IL-8基因在肝脏和脾脏都是在12 h达到最大表达量，在24 h仍处于一个高表达的状态。该表达模式与Sun等[56]的结果相符，半滑舌鳎在鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)的感染下，IL-8基因增长显著并于12 h达到最大值。IL-8是一种多功能的细胞因子，对中性粒细胞、T淋巴细胞及嗜碱性粒细胞具有趋化作用，可以促进炎性反应进展调节宿主免疫，因此当宿主被侵染时会在肝脏和脾脏中快速且大量分泌。相比于IL-1b和IL-8基因短时间内的大量表达，IL-10基因呈现出一种不同的表达模式。红鳍东方鲀IL-10基因在感染初期并无显著应答，肝脏中表达量较低，于24 h被激活显著增长达到峰值；在脾脏中12 h先出现显著上调，在24 h下降后于48 h再次上调达到最高表达量(9.2倍)。这种延迟表达模式在草鱼(Ctenopharyngodonidella)中也有体现[57]，草鱼IL-10基因在TGF-β1诱导后于72 h才开始显著上调。这也印证了IL-10基因的免疫抑制作用，IL-10基因通过抑制一氧化氮的产生而干扰IFN-r对巨噬细胞的活化。Zhang等[58]对小鼠的脾脏进行ADSC输液研究时发现，IL-10基因的表达可抑制促炎细胞因子IL-6、IL-1b和TNF-α的表达。本试验IL-1b和IL-10基因的表达模式与小鼠脾脏的表达模式相符，在哈维氏弧菌感染早期红鳍东方鲀IL-1b基因快速升高，随着12 h后IL-10基因的显著上调IL-1b基因的表达逐渐降低，说明红鳍东方鲀IL-10基因可能也会通过降低IL-1b等炎症细胞因子水平从而达到抑制炎症作用，该机制是一种重要的机体避免炎症反应过度的自我保护。

4 结 论

红鳍东方鲀IL-1b、IL-8和IL-10基因序列全长分别为771、822、844 bp，在进化关系上与双斑东方鲀亲缘关系最近，在红鳍东方鲀的组织中普遍表达，而且在免疫相关组织中表达显著。感染哈维氏弧菌后，脾脏和肝脏组织中IL-1b、IL-8和IL-10基因的表达均发生显著变化，表明其在免疫过程中起调节作用，为进一步探究红鳍东方鲀白介素基因的免疫功能提供基础数据。