盖玉强，张鹏程，韩先杰

青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109

停乳链球菌是链球菌属的一员，是牛、山羊和绵羊急性、慢性乳腺炎的病原菌之一[1]，分停乳链球菌停乳亚种和停乳链球菌类马亚种两个亚种[2]。该菌能通过皮肤伤口、脐带和扁桃体等进入血液，随后导致菌血症或败血症[3]。2020年8月初，某养貉场部分100日龄左右的幼貉发病，表现食欲不振、精神萎靡、消瘦、咳嗽，个别幼貉还表现腹泻、运动失调等临床症状，数日之后死亡，发病率约为6%。剖检发现主要病变为肺脏肿大、表面有出血点，肝、脾肿大、淤血，内脏淋巴结肿大、出血。为了探明幼貉的发病原因，本文从病死貉的肺脏、脾脏中分离出一株细菌，经细菌革兰氏染色及细菌16S rDNA基因鉴定，最后确认该分离菌为停乳链球菌类马亚种。该菌对小鼠有致病性，对阿莫西林等药物敏感，用敏感药物治疗控制病情。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

某养貉场发病死亡仔幼貉的肺、脾脏。

1.1.2 主要试剂

革兰氏染液试剂盒、绵羊血平板、脑心浸液培养基、TSA培养基、葡糖糖、蔗糖等生化反应管等购自青岛海博生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix Taq等购自宝生物工程（大连）有限公司；核酸染料、琼脂糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司。药敏纸片由齐鲁动物保健品有限公司提供，昆明系小白鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

对病死貉的体表消毒后进行解剖，无菌取肺脏、脾脏，在绵羊血平板上进行三区划线、37 ℃培养24～48 h。挑取单菌落进行革兰氏染色，观察菌落形态。另挑取单个菌落接种到已灭菌的脑心浸液肉汤中培养36 h。

1.2.2 生化鉴定

对分离菌分别进行CAMP试验、VP试验、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、水杨苷、七叶苷等代谢试验。

1.2.3 16S rDNA鉴定

根据多种革兰氏阳性菌16S rDNA基因序列，设计、合成一对扩增革兰氏阳性菌16S rDNA的通用引物：上游5′-CCTGCTGTTAGAGAAGAATGA-3′，下游5′-AACACCTGTCACTCCTGCC-3′，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司进行合成。采用煮沸法提取细菌DNA作为模板，进行16S rDNA基因扩增，反应体系（25 µL）为：Premix Taq 12.5 µL、上下游引物各1 µL、DNA模板1.5 µL、无菌去离子水9 µL。PCR扩增程序为：预变性94℃、4min；变性94 ℃、30 s；退火53.6 ℃、30 s，72 ℃延伸30 s，扩增30个循环；终延伸72 ℃、7 min，4 ℃终止反应。

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外投射仪观察结果。

1.2.4 PCR产物测序

将PCR产物送至青岛天泽生物技术有限公司进行基因测序，将所得序列用NCBI的Blast工具进行基因序列的同源性对比。

1.2.5 致病性试验

取小白鼠6只，设试验组和对照组，每组3只。试验组每组腹腔注射含菌脑心浸液0.2 mL，对照组注射等量灭菌脑心浸液。接种后观察小鼠的临诊症状、病理变化，并进行细菌分离。

1.2.6 药敏试验

用纸片扩散法进行药敏试验。将100 µL含菌脑心浸液均匀的涂布于含5%马血清的TSA平板，在培养基的表面贴上青霉素G等药敏纸片，37 ℃培养36 h，随后测量抑菌圈的直径，按照标准判定药物的敏感性[4]。

2 结果

2.1 细菌的培养与形态特征

分离菌在绵羊鲜血平板上培养24 h后似针尖大小，培养48 h后可见呈圆形、直径约0.6～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐的菌落，呈β型溶血。经革兰氏染色，细菌为G+球菌，呈圆形或卵圆形，少数单个或者成对存在，多成短链状排列。

2.2 分离菌生化试验

分离菌CAMP试验阴性、VP试验阴性，发酵葡萄糖和蔗糖，能利用水杨苷，不利用乳糖、菊糖、甘露醇、山梨醇和七叶苷（见表1）。

表1 细菌的生化试验结果

2.3 16S rDNA基因扩增与序列分析

分离菌的16S rDNA的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳和紫外透射仪观察，扩增的特异性条带大小约为746 bp，与预期扩增大小相符。经Blast同源性比较，分离菌的16S rDNA序列与停乳链球菌似马亚种（序列号MN880121）同源性达到99.72%。

2.4 动物致病性试验

实验组接种含菌肉汤12 h后，小鼠表现精神萎靡、不愿活动、身体蜷缩、呼吸急促，3只攻毒小鼠在48 h内死亡。死亡小鼠解剖病变主要表现肝、脾和肾肿胀、淤血，肺肿胀、充血。对照组小鼠一直健康存活。取死亡小鼠的病变组织接种绵羊鲜血平板，分离的细菌菌落形态和菌体染色特征与2.1的结果一致。

2.5 药敏试验

经测量所用药敏纸片对分离菌的抑菌圈直径，依据药物的敏感性判定标准，该菌对阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋和恩诺沙星敏感，对氟苯尼考、卡那霉素为中敏，对林可霉素、强力霉素、多粘菌素B耐药。选用阿莫西林进行治疗。

3 讨论

本文从发病仔貉的肺脏、脾脏分离一株细菌，经细菌革兰氏染色、细菌16S rDNA基因测序和同源性比较，确定病原为停乳链球菌似马亚种。为了进一步探明仔貉感染停乳链球菌的原因，经过深入调查得知，发病的幼貉均为出生较晚的一批，这些幼貉出生后表现发育不良，养殖场为了增加幼貉的营养，在饲喂日常配制饲料以外，还为其提供羊奶，羊奶来自同村一个山羊养殖户。通过实验室进一步对该山羊所产羊奶的微生物检测，检测出的停乳链球菌与发病幼貉体内的一致。

立即对患病幼貉进行隔离治疗，每只幼貉按15 mg/kg注射阿莫西林，每天1次，连用3 d。同时用0.5%的过氧乙酸对笼具及笼下的粪便、毛屑等消毒。对幼貉停喂生羊奶，将生羊奶煮沸10 min待冷却后再饲喂。采取上述措施后1周左右病情被控制，再无新的病例发生。