张光磊，梁云坤，金丽兰

吉林省敦化市农业农村局畜牧站，吉林敦化 133700

胰岛移植被认为是治疗Ⅰ型糖尿病的最理想的方法。猪胰岛细胞和人胰岛细胞的氨基酸序列仅相差一个，能够在人体内发挥调节血糖水平的正常功能。所以，猪胰岛已经成为治疗人Ⅰ型糖尿病的最理想供体。关于猪胰岛分离纯化方面已经积累了大量研究资料。结果表明，猪胰腺结缔组织发达，内分泌与外分泌连接紧密；胰岛周围缺乏被摸保护，容易破碎。此外，猪的年龄、品系和体外缺血时间等同样是影响胰岛产量和活力的客观因素。此外，朱海涛等认为猪胰岛细胞一般来源于胎猪、新生猪或成年猪，但是何时期的猪胰岛细胞更适合于人类进行异种移植，现仍存在争议。因此，本试验为进一步探讨完善并建立猪胰岛细胞分离纯化方法提供参考数据，以出生1日龄、50日龄、100日龄、150日龄猪为试验动物，采用胶原酶注射法、DTZ染色法、histopaque法等进行猪胰岛形态学观察及胰岛分离纯化，并采用葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测1日龄和150日龄猪胰岛体外功能。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验选用出生1日龄、50日龄、100日龄及150日龄健康长白猪的胰腺组织各5例。

1.2 试剂与仪器

试剂：胶原酶Ⅴ、DTZ（双硫腙）、Histopaque-1077、Hanks、台盼蓝均购自于Sigma公司；胎牛血清、RPMI-1640购于Gibco公司；ELISA检测试剂盒购于RD公司。主要仪器设备：实体显微镜（OLYMPUS）、卧式圆形压力蒸汽灭菌器（TOMY KOGYO）、二氧化碳培养箱（Sanyo MCO-18AIC）、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平，离心机，超级洁净工作台等。

1.3 方法

1.3.1 猪胰腺的取材

1日龄、50日龄猪的胰腺于实验室采用外科手术方法获得，而100日龄、150日龄猪的胰腺取自龙井市屠宰场。取材时，保证热缺血小于10 min和冷缺血时间小于30 min。取材后，立即剥离胰腺组织，用含双抗Hanks液清洗，并放入RPMI-1640缓冲液置于保温箱中。剥离胰腺时注意无菌环境低温条件操作，同时运用含双抗生理盐水或4 ℃的冷Hanks液清洗。

1.3.2 胰岛细胞消化

找到胰腺组织的胰管注射胶原酶消化液结扎后，放入37 ℃水浴锅中静置消化，震荡数次，组织变为细沙状后加入终止液，翻转，滤网过滤，收集分离物，DTZ染色，观察分离物形态学特征。

1.3.3 胰岛细胞分离纯化

胰岛纯化分离物悬液转入离心管，离心弃上清液，加入终止液洗涤翻转，反复操作两次。将Histopaque-1077与沉淀物混匀，再缓慢倾斜加入等量DMEM培养液，使两种液体出现分层，进行离心，离心后，离心管中液体分层明显，两层间存在悬浮物为猪胰岛细胞聚集团，吸取离心管中的全部胰岛，加入培养液混匀，离心弃上清，反复操作两次。收集胰岛细胞，并且体外培养同时进行胰岛体外胰岛素释放功能测定。

1.3.4 胰岛计数和提纯

运用特异性DTZ染色法，胰岛染成猩红色，非胰岛细胞不着色，染色后对胰岛在显微镜下观察计数，统计出胰岛个数、纯度和胰岛直径大小。

1.3.5 体外培养胰岛素释放测定

对分离纯化后的胰岛进行台盼蓝染色，染色后统计胰岛细胞存活率，被染成蓝色细胞为死细胞，不着色为活细胞。

1.3.6 胰岛体外功能测定

挑选纯化后的胰岛细胞，并适应体外培养基，同时分组培养，在48孔培养板中加入RPMI-1640培养液，随后将分好组的胰岛细胞放入，收集上清液并用ELISA试剂盒进行胰岛素含量测定。

1.3.7 统计学方法

通过SPSS统计软件分析数据，数据差异显著性进行单因素ANOVA、t检验，p＜0.05为有意义。

2 结果

2.1 不同日龄猪胰岛的形态学特点

高清显微镜下可见胰岛细胞呈不规则圆形或者椭圆形，大小不一，表面较为光滑，多数胰岛细胞包膜完整，存在极少数破裂细胞碎片。分离后胰岛DTZ染色，每年龄段随机抽取20个胰岛测量其直径。结果见表1。

表1 不同日龄猪胰岛DTZ染色直径比较

2.2 不同日龄的猪胰岛细胞获得量、分离纯度和存活率

在热缺血时间少于10 min，冷缺血时间少于30 min，胶原酶配置浓度1.0 mg/mL或1.5 mg/mL，消化时间15 min为基准，取相同部位胰腺分离纯化，不同日龄组猪胰岛获得量、胰岛细胞数量和分离纯度上均有显著差异（p＜0.05），不同组间数据也具有显著性（p＜0.05）。

表2 不同日龄猪胰岛团收获量、纯度及存活率

2.3 1日龄和150日龄猪胰岛葡萄糖刺激胰岛素释放检测结果

表3 猪胰岛素释放量

由表3可知，两组间比较，差异显著(p＜0.05)。

3 讨论

目前有很多研究者研究猪胰岛细胞的分离纯化，在小鼠和大鼠中也应用胆总管穿刺法等一系列方法。每种方法存在各种不同客观影响因素，从而在胰岛分离数量上有显著差异。在猪胰岛分离中，胰管注射法只有少量学者采用，原因在于猪胰管位置难以确定并且胰管开口细小难以分辨，所消耗药品尤其是胶原蛋白酶量非常大，成本高效率低。由于1日龄猪胰腺腺体发育未完全，直接可以采用腺体注射，结扎并消化，这种办法解决了对消化效果的影响并节省药品。在纯化方法上，现普遍应用的是Ficoll密度梯度离心法，国内只在大鼠和小鼠的胰岛消化中使用Histopaque-1077纯化方法，但在猪胰岛纯化中未见发表。该法对比Ficoll密度梯度离心法结果，操作过程相对简易，但提纯略低，Histopaque-1077纯化方法对猪胰岛纯化效果有待于进一步的探讨。

对于消化时间和胶原酶浓度的研究，多数学者认为完全消化程度体现在出现白色小颗粒物质并呈现泥沙状。在前期工作中，探讨了胶原酶浓度、消化时间及对不同日龄猪胰岛分离纯化的影响，结果表明，出生1日龄和50日龄猪最佳胶原酶浓度为1 mg/mL、消化时间为15 min，能获得较为完整的胰岛细胞，消化时间在30～45 min之间时，虽然胰腺组织可以消化成泥沙状，经DTZ染色镜下观察看到胰岛聚集组织出现过多碎片，100日龄与150日龄组中最佳胶原酶浓度为1.5 mg/mL、消化时间确定为15 min，这样可以得到较多的胰岛细胞，胶原酶浓度为2 mg/mL时容易使胰岛出现破裂现象。因此，本试验中1日龄和50日龄的猪胰腺消化试验中，采用胶原酶浓度为1 mg/mL、消化时间为15 min，而100日龄及以上日龄猪采用的成年猪胶原酶浓度为1.5 mg/mL、消化时间为15 min，该结果与Jin SM 等学者发表过的胶原酶1.0 mg/mL、1.8 mg/mL浓度比较，消化时间长短，胰岛数量上存在不显著差异。

因此可以确定猪日龄增长的同时，体内胰岛数量亦在增加。不同的胰岛细胞分泌不同的激素，因此胰岛细胞在胚胎后发育中处于正常分化状态，同时猪胰岛B细胞同时分泌两种不同的激素，说明猪胰岛细胞有一定的分化增生能力。

参考文献：略