刘肖静,王旭静,王志兴

中国农业科学院生物技术研究所, 农业农村部农业转基因生物安全评价(分子)重点实验室, 北京 100081

CRISPR-Cas9技术的原理是在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对特定的双链DNA进行切割，利用细胞的天然修复机制可以发生碱基的插入、替换和缺失，从而造成移码突变，实现功能基因的鉴定，获得和培育优良性状的农作物。由于该技术操作简单、高效，因而成为科学研究不可或缺的工具。本文简单地回顾了CRISPR-Cas9的作用原理，详细介绍了最新开发的一系列CRISPR变体，归纳总结了CRISPR-Cas系统在植物中的应用、现阶段面临的挑战、基因编辑植物检测方法与各国的监管政策，以期为CRISPR-Cas系统在植物中的应用研究及监管研究提供参考。

1 CRISPR-Cas9系统的作用原理

在细菌的天然免疫系统内首次发现了CRISPR-Cas家族，它的主要功能是对抗外来入侵的病毒及DNA，包括CRISPR基因座和Cas基因两部分。根据Cas的数目和功能将其分为两个大类共6种类型(Ⅰ～Ⅵ)[1]，其中第一大类包含有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，它们在靶向切割目标序列时需要多个Cas蛋白协同工作；Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型属于第二大类，区别于第一大类，它们只需要单一的Cas蛋白就能够靶向目标序列。在这两类系统中第二类中的Ⅱ型系统因其组成较为简单，仅以一个Cas9蛋白及向导RNA(gRNA)为核心组成，所以是目前使用最广泛的基因编辑工具[2]，工作原理如图1所示。

图1 CRISPR-Cas系统的工作原理[3]Fig.1 Natural mechanisms of CRISPR-Cas system[3]

2 新型植物基因编辑器的开发

2.1 CRISPR-Cas12a

Cas12a也被称为Cpf1，是与Cas9最为相似的一个系统。它识别的PAM序列是5′-TTTV-3′，作用原理为利用RuvC-like结构域在crRNA引导下即可切割双链DNA，不需tracrRNA的参与且切割后产生黏性末端，有利于提高基因定点插入的效率；……