梁明星,马梦琪,程盈盈,王媛,陈华波

湖北文理学院医学院, 湖北 襄阳 441053

基因定点突变是常用的分子生物学研究方法。通过突变基因特定位点的碱基序列，改变其编码蛋白质对应的氨基酸序列，从而影响目标蛋白质的酶活性[1]、受修饰位点或与其他蛋白质的结合能力[2]，藉此研究蛋白质的结构、功能、上下游调控关系、亚细胞定位等特征。

基因定点突变的方法主要有重叠延伸PCR(overlap extension PCR, OE-PCR)[3-4]、滚环扩增法[5-6]、大引物PCR法[7-8]等，每种方法各有优劣。其中，OE-PCR法虽步骤繁琐，但适当改进后可解决基因定点突变中的诸多难题。如采用平行模板可有效减少原始质粒对突变产物的干扰[9]；采用多片段重叠延伸可一次性制作基因多位点突变[10]。因此，OE-PCR定点突变法仍然受到大量科研工作者的青睐。而OE-PCR法也有一定缺陷。其一，OE-PCR第二轮扩增成功与否受上、下游片段长度和使用比例、重叠区域长度及序列特征等诸多因素影响。一般随着上、下游片段长度增加，扩增成功率逐渐降低[11]。经常遇到第二轮PCR无法扩增出目标产物，却难以找到关键制约因素，只能反复调整反应条件的情况。其二，与其他基因定点突变方法一样，基于体外扩增DNA的定点突变都存在随机突变风险，且随目标基因长度增加而增加。因此，缩短OE-PCR过程中待扩增DNA长度，可有效提高基因定点突变效率。

周期蛋白E(cyclin E)是周期蛋白家族的重要成员，通过激活周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2, CDK2)在G1/S转换中发挥作用[12]。cyclinE有2个重要截短基因(truncated gene 1 and 2, T1 and T2)，称为低分子量cyclin E(low molecular weight cyclin E, LMW cyclin E)[13-14]。……