郭 莹，惠 明*，田 青，黄继红，王洪照

1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001 2.河南豫坡酒业有限责任公司，河南 驻马店 463900

以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒在我国销量最大，因其具有香味浓郁、口味醇厚的特征而备受许多消费者青睐[1]。醇、酸、醛、酯是白酒的呈香呈味物质，仅占总量的2%左右，各成分的比例决定着白酒的质量和风格。常说“老窖产好酒”，不同窖龄窖池会产不同品质的白酒，但是实际生产中发现相同窖龄、相同原料、相同发酵蒸馏工艺的不同窖池也会产生不同品质的白酒。窖泥是浓香型白酒发酵的基础，窖泥中微生物菌群质量对酒的质量有决定性的影响[2]。研究窖泥微生物方法包括纯培养的传统方法及TA克隆文库[3]、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA[4])、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE[5])、荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH[6])等现代分子生物学方法。相比以上方法，第2代高通量测序技术具有明显优势，可产生大量数据、准确率高，可在“属”水平上全面揭示环境中微生物群落信息[7]。赵东等[8]通过高通量测序技术分析了不同窖泥中原核微生物的多样性及丰度，揭示了己酸菌群和甲烷菌群对浓香型酒风味品质的影响。该研究是豫酒振兴计划项目的一部分，作者以地方特色酒“豫坡老基酒”为对象，分析窖泥微生物组成对白酒风味品质的影响，为企业酒质提升和维持稳定提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2个相同窖龄、相同原料、相同生产工艺的窖池所产的基酒及对应窖池的窖泥：河南豫坡酒业有限责任公司。窖龄均为50 a，窖泥编号分别为LB和HA。窖泥取样采用5点取样法[9]。

氯化钠：分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；FastDNA® SPIN Kit for Soil：MP Biomedicals生物医学公司；琼脂糖：Biowest公司；FastPfu Polymerase：TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit：Axygen公司；建库试剂盒：Bioo Scientific；测序试剂盒：美国Illumina公司。

1.2 主要仪器与设备

Agilent 7890 A-5975C GC/MS气相色谱质谱联用仪和20 mL顶空进样瓶：美国Agilent公司；固相微萃取装置(SPME手柄、65 μm PDMS/DVB萃取头)：西格玛奥德里奇公司； DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；ABI GeneAmp® 9700型PCR仪：北京赛百奥科技有限公司；Miseq高通量测序平台：美国Illumina公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基酒挥发性成分的检测

基酒中挥发性成分的测定采用HS-SPME-GC-MS[10]。

1.3.2 DNA提取

用FastDNA® SPIN Kit for Soil快速提取试剂盒提取窖泥中微生物基因组 DNA，-20 ℃保存。

1.3.3 PCR扩增及高通量测序

提取基因组DNA作为模板，采用细菌16S V3-V4可变区的引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，古菌的16S V4-V5可变区的引物524F10extF(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和Arch958RmodR(5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)，真菌的18S V5-V7可变区的引物SSU0817F(5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’)和1196R(5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’)进行PCR扩增。PCR扩增条件参考杨小丽等[11]的方法。PCR扩增后产物纯化回收，由上海美吉生物医药科技有限公司通过Illumina Miseq平台进行高通量测序。基于上海美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 基酒中主要挥发性成分的GC-MS分析

对两个相同窖龄、相同原料、相同工艺窖池所产基酒进行挥发性成分 GC-MS 检测，用面积归一化法得出基酒中主要挥发性成分相对含量，相对含量>1%的挥发性成分见表1。

酒质的差异实际上是白酒中呈香物质组成的差异。从表1可以看出，HA基酒中相对含量大于1%的挥发性成分中酯的种类更丰富，且己酸乙酯的相对含量较高，浓香型风格更突出，品质较好。生产LB基酒、HA基酒的两个窖池窖龄相同，生产中所用的原料、发酵蒸馏工艺也相同，但产出的基酒品质不同，根本原因是酿酒微生物群落组成差异[12]。窖泥是浓香型白酒发酵的基础，为了解影响基酒品质的根本原因，需进一步分析窖泥中微生物菌群结构。

表1 基酒中主要挥发性成分及相对含量Table 1 Main volatile components and their relative content of base wine

2.2 窖泥细菌多样性分析

对LB和HA窖泥细菌的16S rDNA V3-V4区进行高通量测序，经统计，窖泥样品读取的序列数分别为46 690和69 512，抽平后被利用上的序列数均为38 463，序列平均长度分别为 418.24 bp和410.28 bp。样品Shannon 指数(2.92、3.53)、Chao指数(387.63、427.71)和Shannoneven指数(0.50、0.60)均表现为HA窖泥高于LB窖泥，说明HA窖泥细菌群落有更高的物种多样性、群落丰富度及群落均匀度。Coverage指数分别为99.83%和99.82%，Coverage指数表明测序已覆盖到样品中几乎所有的物种，本次测序结果可以代表样品中微生物真实情况。

2.3 窖泥细菌群落结构组成分析

根据16S高通量测序的序列数据，这2个窖泥样品中细菌主要分布在 9个门、19个纲、41个目、85个科和 176个属。在门水平上，LB窖泥物种隶属于拟杆菌门(Bacteroidetes)(70.05%)、厚壁菌门(Firmicutes)(28.77%)和其他门。HA窖泥物种隶属于厚壁菌门(Firmicutes)(72.17%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(27.11%)和其他门。厚壁菌门(Firmicutes)在HA窖泥中丰度较大，拟杆菌门(Bacteroidetes)在LB窖泥中丰度较大。窖泥样品中平均相对含量>1.0%的细菌门如图1a所示。

在属水平上，LB窖泥中主要的优势物种为产乙酸嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)(57.53%)、氢孢菌属(Hydrogenispora)(7.98%)、沉积菌属(Sedimentibacter)(4.11%)、产己酸菌属(Caproiciproducens)(0.97%)、Clostridium_sensu_stricto_12(2.13%)、norank_f_Marinilabiliaceae(7.89%)、三角菌属(Petrimonas)(4.34%)、Christensenellaceae_R-7_group(2.87%)。HA窖泥中主要的优势物种为产乙酸嗜蛋白菌属(Proteiniphilum)(24.92%)、氢孢菌属(Hydrogenispora)(28.55%)、沉积菌属(Sedimentibacter)(6.53%)、产己酸菌属(Caproiciproducens)(8.41%)、Clostridium_sensu_stricto_12(6.01%)、三角菌属(Petrimonas)(1.31%)、泰氏菌属(Tissierella)(2.35%)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)(1.49%)、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)(1.42%)、norank_f_Clostridiaceae_1(1.63%)、Caldicoprobacter(1.35%)、norank_f_Family_XIV(1.35%)。窖泥中的这些微生物可以产生有机酸、醇类、醛类、氨基酸等白酒中关键的风味成分及其前体物质。可以产生己酸、丁酸等白酒重要风味物质的产己酸菌属(Caproiciproducens)和Clostridium_sensu_stricto_12在HA窖泥中丰度更大。根据已知的菌属的代谢功能，产己酸菌属(Caproiciproducens[13])和梭菌属(Clostridium[14-15])可以通过厌氧发酵生成H2、CO2、丁酸和己酸。窖泥样品中丰度>1.0%的细菌属如图1b所示。

图1 窖泥样品中细菌门和属水平的物种组成Fig.1 Composition of bacterial community at the phylum and genus level in pit muds

2.4 窖泥古菌多样性分析

对LB窖泥和HA窖泥古菌的16S rDNA V4-V5区进行高通量测序，窖泥样品中读取序列数分别为57 878和43 723，抽平后最终被利用上的序列数均为35 469，序列平均长度分别为429.80 bp和429.91 bp。样品Shannon 指数(1.21、0.88)、Chao指数(42.67、18.5)和Shannoneven指数(0.33、0.32)均表现为LB窖泥高于HA窖泥，说明LB窖泥古菌群落有更高的物种多样性、群落丰富度和群落均匀度。测序深度指数Coverage分别为99.98%和99.99%，Coverage指数表明测序已覆盖到样品中几乎所有的物种，本次测序结果可以代表样品中微生物真实情况。

2.5 窖泥古菌群落结构组成分析

在2个窖泥样品中，古菌的微生物群落变化相对简单，主要分布在 4个门、6个纲、7个目、7个科和 11 个属。广古菌门(Euryarchaeota)在LB和HA窖泥中均占绝对优势，丰度分别为98.59%和99.88%。窖泥样品中丰度>1.0%的古菌门如图2a所示。

在属水平上，LB窖泥中优势古菌微生物为甲烷杆菌属(Methanobacterium)(52.35%)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)(40.35%)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)(4.83%)和Methanomassiliicoccus(0.99%)。HA窖泥中优势古菌微生物为甲烷杆菌属(Methanobacterium)(69.41%)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)(27.44%)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)(1.84%)和Methanomassiliicoccus(1.10%)。甲烷菌的存在代表着窖泥菌群代谢链的完善，是窖泥老熟的标志[16]。甲烷菌可以与产氢气菌(如梭菌和己酸菌)之间进行氢转移。甲烷杆菌属(Methanobacterium)以H2、甲酸盐、二元醇和CO为电子供体，以还原CO2为CH4作为能量代谢来源。甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)产生CH4的途径有：裂解乙酸生成CH4,以CO2和H2为原料合成CH4,以各种甲基化合物(甲醇、甲胺、甲基硫化物)为底物生成CH4[17]。窖泥样品中丰度>1.0%的古菌属如图2b所示。

图2 窖泥样品古菌门和属水平物种组成Fig.2 Composition of archaea community at the phylum and genus level in pit muds

2.6 窖泥真菌多样性分析

对LB和HA窖泥真菌的18S V5-V7区进行高通量测序，经统计，这2个窖泥读取的序列数分别为59 593和51 429，抽平后得到的序列数均为42 532，序列平均长度分别为381.86 bp和381.11 bp。Shannon指数(0.80、0.86)和Shannoneven指数(0.27、0.32)均表现为HA窖泥大于LB窖泥，说明HA窖泥有更高的群落多样性和群落均匀度，而Chao指数(20、16)表现为LB窖泥大于HA窖泥，说明LB窖泥有更高的群落丰富度。Coverage指数均大于99.99%，Coverage指数表明测序已覆盖到样品中几乎所有的物种，本次测序结果可以代表样品中微生物真实情况。

2.7 窖泥真菌群落结构组成分析

这2个窖龄窖泥样品中真菌主要分布在 9个门，15个纲，19个目，24个科和 26个属。子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)在LB和HA窖泥中丰度分别为95.38%和55.66%、0.55%和42.54%。纤毛亚门(Ciliophora)在LB窖泥中丰度为2.26%。从图3可以看出，担子菌门(Basidiomycota)在HA窖泥中丰度显著大于LB窖泥，可能是影响产酒品质的重要因素。窖泥样品中丰度>1.0%的真菌门如图3a所示。

在属水平上，LB窖泥优势物种为unclassified_f_Aspergillaceae(87.70%)、unclassified_f_Trichosporonaceae(0.55%)、unclassified_f_Saccharomycetaceae(2.31%)、毛壳菌属(Chaetomium)(0.06%)、镰刀菌属(Fusarium)(2.62%)、norank_p_Mucoromycota(1.43%)、unclassified_f_Colpodea(2.26%)、Candida-Lodderomyces_clade(1.66%)。HA窖泥优势物种为unclassified_f_Aspergillaceae(18.16%)、unclassified_f_Trichosporonaceae(38.62%)、unclassified_f_Saccharomycetaceae(12.42%)、毛壳菌属(Chaetomium)(13.56%)、镰刀菌属(Fusarium)(6.19%)、马拉色菌属(Malassezia)(3.90%)、枝孢属(Cladosporium)(2.94%)、norank_p_Mucoromycota(1.04%)、毕赤酵母属(Pichia)(1.83%)。unclassified_f_Aspergillaceae是LB窖泥中绝对优势菌属，丰度为87.70%。从图3b中也可看到HA窖泥中各菌属分布更加均匀。窖泥样品中丰度>1.0%的真菌属如图3b所示。

图3 窖泥样品真菌门和属水平物种组成Fig.3 Composition of fungal community at the phylum and genus level in pit muds

3 结论

采用GC-MS分析检测了河南豫坡酒厂提供的2个相同窖龄、相同原料、相同生产工艺的窖池所产基酒，发现这两个基酒品质不相同。基于基酒品质的不同，通过Miseq平台高通量测序技术，分析了这两个基酒对应窖池窖泥中细菌、古菌及真菌群落多样性。结果表明，产基酒品质较好的窖泥中细菌和真菌物种分布更加均匀，与白酒香味物质生成有关的Clostridium_sensu_stricto_12和产己酸菌属(Caproiciproducens)在产基酒品质较好的窖泥中丰度更高。古菌微生物群落结构在两个窖泥中变化简单。通过对相同窖龄、相同原料、相同生产工艺但产不同品质基酒的2个窖池窖泥微生物群落结构的差异性分析，证实了窖泥微生物菌群结构是影响基酒质量的根本原因，揭示了“老窖产好酒”的决定因素不是“窖龄”，实质上是有优质质量的菌群结构。因此，为保持基酒品质的稳定，养护窖池、维持窖泥微生物结构的稳定性至关重要。