陈兴峰 张秀峰 石慧芳 何海武

(海南医学院第二附属医院呼吸内科，海口 570311)

气道、血管和胃肠道平滑肌细胞可以诱导分泌大量生物活性分子，促进炎症反应和免疫调节[1-2]。其中气道平滑肌(airway smooth muscle,ASM)细胞合成并释放的细胞因子参与气道高反应性，在支气管哮喘发病过程中促进气道重塑，其分泌的主要炎症因子包括IL-1β、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)/趋化因子配体2(CCL2)，它们均依赖于ASM细胞中丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路中p38丝裂原的激活，MAPK信号通路的传导参与支气管哮喘的过敏性损伤[3-4]。MK2和MK3属于MAPK活化蛋白激酶(MKs)，主要由p38 a/b MAPK激活[5-6]。虽然MK2和MK3具有相同的底物识别序列，在相同的细胞应激和炎症刺激时可被激活[7-9]，但MK2在体内的表达和活性却明显强于MK3[10]。MK2中富含脯氨酸的SH3结合结构域，可调节各种类型细胞的迁移，MK3不具有此功能[11]。本研究从支气管中分离出支气管平滑肌细胞，通过腺病毒感染后使MK2、MK3高表达，检测MK2、MK3过表达对细胞因子分泌的影响并进一步分析其作用机制，为支气管哮喘的治疗提供可靠的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 野生型MK2(MK2WT)、野生型MK3(MK2WT)腺病毒和腺病毒载体pAdTrack-CMV由上海中洪博元生物技术有限公司合成；M199培养液、胎牛血清、人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子和胰岛素购于赛默飞公司；庆大霉素、两性霉素B和PBS溶液购于北京鼎国技术有限公司；D-Hanks购于北京索莱宝有限公司；IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)细胞因子购于美国Upstate Biotechnology公司；SDS-PAGE细胞裂解液购于碧云天生物技术有限公司；抗-磷酸化热休克蛋白2(rHSP2)、抗-p38MAPK、抗-p-p38MAPK、抗-核因子κB抑制因子α(IκBα)、抗-β-actin、辣根过氧化物酶标记的二抗均购于美国Cell Signaling Technology公司；ELISA试剂盒购于上海酶联生物公司。

1.2方法

1.2.1原代支气管平滑肌细胞的分离培养 取在我院进行肺切除手术的肺癌患者癌症旁组织中的主支气管，分离培养人支气管平滑肌细胞，患者知情同意并签署知情同意书。采取组织块贴壁培养法分离培养原代支气管平滑肌细胞。具体方法如下：将分离的主支气管放入含100 U/ml双抗的D-Hanks液中，在超净台中去除血污及多余的结缔组织，纵行剖开气管，去除外膜和内膜，用眼科剪将气管剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小组织块，贴在6 cm的培养皿底部放置于恒温箱中。待组织块干涸后加入2 ml含20%胎牛血清的M199培养液，静置3 d后再加入3 ml 同样的培养液，以后每3 d换一次培养液，直至培养出原代支气管平滑肌细胞。第4～7代细胞置于体积分数为5%CO2、37℃恒温箱中孵育。M199培养液中含10%胎牛血清、0.5 ng/ml人表皮生长因子、2 ng/ml 人成纤维细胞生长因子、 5 μg/ml培养液胰岛素、 50 μg/ml庆大霉素和50 ng/ml两性霉素B。

1.2.2Western blot实验

1.2.2.1MK2和MK3蛋白的过表达 当细胞密度生长至80%～90%时，去除上清液，进行以下处理：对照组在培养皿中滴加腺病毒载体pAdTrack-CMV，实验组在培养皿中滴加含MK2、MK3的腺病毒[设置不同的感染系数(MOI)：20、40、80]，用含0.1%胎牛血清的M199 200 μl孵育1 h。去除上清液，加入含0.1%胎牛血清的M199培养液继续培养24 h。收集实验组细胞和对照组细胞，用SDS-PAGE细胞裂解液将其裂解，BCA蛋白定量试剂盒取30 μg蛋白。分别配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜上。根据Marker和目的蛋白相对分子质量大小切取适当大小的膜，用5%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶1 000)过夜孵育，TBST溶液清洗，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，TBST溶液清洗。配置适量显影液，均匀滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝胶成像系统中拍照。MK2、MK3蛋白表达相对稳定时所对应的感染系数为最佳感染系数。

1.2.2.2磷酸化rHSP27及MAPK和NF-κB信号通路中关键蛋白的表达 收集经促炎因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ，质量浓度均为10 ng/ml)刺激24 h的感染MK2WT、MK3WT腺病毒的支气管平滑肌细胞以及对照组细胞(分别标记为：MK2WT-T、MK3WT-T、Control-T)和未经促炎因子刺激的感染MK2WT、MK3WT腺病毒的支气管平滑肌细胞以及对照组细胞(分别标记为：MK2WT-N、MK3WT-N、Control-N)，采用Western blot检测各组细胞中磷酸化rHSP27及MAPK和NF-κB信号通路中关键蛋白的表达，具体方法同1.2.2.1。以目的蛋白灰度值与内参蛋白β-actin灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。以对照组中促炎因子未处理组目的蛋白相对表达量为1。

1.2.3ELISA检测细胞因子分泌水平

1.2.3.1促炎因子处理组及促炎因子未处理组 促炎因子处理组：用含IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子(质量浓度均为10 ng/ml)的培养液处理支气管平滑肌细胞24 h，收集细胞培养液。促炎因子未处理组：在培养液中加入相同体积的PBS溶液作为对照，处理支气管平滑肌细胞24 h，收集细胞培养液。根据ELISA试剂盒检测IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、MCP-1/CCL2、RANTES/CCL5的含量。在检测之前应先确定每个细胞因子的稀释浓度，以确保检测值在标准曲线的检测范围之内。

1.2.3.2腺病毒处理组和对照组 使用AdEasy系统构建重组腺病毒，将MK2WT和MK3WT质粒克隆至pAdTrack-VMV载体上。然后转染至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy的大肠杆菌宿主菌株BJ5183中，筛选出具有卡那霉素抗性的MK2WT和MK3WT质粒。腺病毒处理组：将感染系数为40的MK2WT、MK3WT腺病毒感染支气管平滑肌细胞；对照组：腺病毒载体pAdTrack-CMV感染支气管平滑肌细胞。腺病毒处理组和对照组均用含IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子(质量浓度均为10 ng/ml)的培养液培养细胞24 h，收集细胞培养液。采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的水平。以对照组RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的表达水平为1，计算其余各组相对于对照组RANTES/CCL5、MCP-1/CCL2和IL-6的表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计分析，Graphad Prism5和Photoshop软件作图，所有数据以χ2表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1原代培养的支气管平滑肌细胞 分离出的支气管平滑肌细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形，培养大约2周后细胞融合，多数细胞伸展成梭形，有分支突起，细胞密度低时常交织成网状(图1)，细胞密度高时则排列成旋涡状。

2.2MK2、MK3蛋白在支气管平滑肌细胞中的过表达及腺病毒最佳感染系数 结果见图2。支气管平滑肌细胞感染野生型腺病毒后，与未感染腺病毒组相比MK2、MK3蛋白表达均增加。当腺病毒感染系数达到40时，MK2、MK3蛋白表达相对稳定，故在后续的实验中均采用感染系数40进行实验。

2.3腺病毒感染支气管平滑肌细胞后MK2、MK3蛋白的活性 通过检测rHSP27的磷酸化水平反映MK2、MK3蛋白的活性。结果见图3。促炎因子处理组感染MK2WT腺病毒的细胞中rHSP27磷酸化水平高于促炎因子未处理组感染MK2WT腺病毒的细胞，组间差异具有统计学意义(P<0.001)。同时促炎因子处理组感染MK3WT腺病毒的细胞中rHSP27磷酸化水平高于促炎因子未处理组感染MK3WT腺病毒的细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。MK2WT和MK3WT促炎因子处理组rHSP27磷酸化水平均高于对照组促炎因子处理组(P<0.001)。

图1 原代培养的支气管平滑肌细胞Fig.1 Primary cultured bronchial smooth muscle cells

图2 腺病毒感染支气管平滑肌细胞后MK2、MK3的过表达Fig.2 Overexpression of MK2 and MK3 after adenovirus infection of bronchial smooth muscle cells

2.4支气管平滑肌细胞中MK2、MK3的过表达对细胞因子分泌的影响 结果如表1所示，促炎因子刺激后，支气管平滑肌细胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ和RANTES/CCL5增加，从而促进IL-6和MCP-1/CCL2的分泌(P<0.05)，但对IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p70)和IL-13的分泌没有影响。由图4可见，MK2WT、MK3WT腺病毒感染支气管平滑肌细胞后，用同样的促炎因子刺激，与对照组比较，MK2WT组细胞分泌IL-6水平增加，MK3WT组细胞分泌IL-6水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，MK2WT组和MK3WT组细胞分泌RANTES/CCL5水平均降低(P<0.001)。

2.5支气管平滑肌细胞中MK2和MK3的过表达对MAPK和NF-κB信号通路的影响 结果见图5、图6。对照组、MK2WT和MK3WT促炎因子处理后与未经促炎因子处理相比p38MAPK的表达水平增加(P<0.001)，MK2WT和MK3WT促炎因子处理组与对照组促炎因子处理组相比，MK2WT促炎因子处理组磷酸化p38MAPK的表达水平高于对照组促炎因子处理组(P<0.001)，MK3WT促炎因子处理组磷酸化p38MAPK的表达水平与对照组促炎因子处理组相比无统计学差异，MK2WT组中磷酸化p38MAPK的表达水平高于MK3WT组(P<0.001)，说明MAPK信号通路的激活主要依赖于MK2；对照组、MK2WT和MK3WT促炎因子处理后与未经促炎因子处理相比IκBα的表达水平降低(P<0.01)，说明NF-κB信号通路被激活，MK2WT促炎因子处理后IκBα的表达水平高于对照组促炎因子处理组(P<0.001)，MK3WT的腺病毒组IκBα的表达水平低于感染MK2WT的腺病毒组(P<0.05)，故NF-κB信号通路的激活主要依赖于MK3。

图3 磷酸化热休克蛋白27蛋白水平变化Fig.3 Changes in phosphorylated heat shock protein 27 protein levelsNote:1.Control-N；2.Control-T；3.MK2WT-N；4.MK2WT-T；5.MK3WT-N；6.MK3WT-T.

表1 促炎因子刺激支气管平滑肌细胞分泌细胞因子

图4 腺病毒感染支气管平滑肌细胞后对MK2、MK3蛋白活性的影响Fig.4 Effect of adenovirus infection on bronchial smooth muscle cells on MK2 and MK3 protein activityNote:Gray level analysis of the phosphorylated heat shock protein 27 protein band was performed to calculate the relative expression level of the untreated histone relative to the control inflammatory factor;**.P<0.001 vs MK2WT-Non-treatde；*.P<0.05 vs MK3WT-Non-treatde.

图5 MK2、MK3对支气管平滑肌细胞IL-6和RANTES/CCL5分泌的影响Fig.5 Effect of MK2 and MK3 on IL-6 and RANTES/CCL5 secretion in bronchial smooth muscle cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs Control.

图6 MK2、MK3过表达对MAPK和NF-κB信号通路的影响Fig.6 Effect of MK2 and MK3 overexpression on MAPK and NF-κB signaling pathwaysNote:1.Control-N；2.Control-T；3.MK2WT-N；4.MK2WT-T；5.MK3WT-N；6.MK3WT-T.**.P<0.01,***.P<0.001 vs Control-Treated；###.P<0.001 vs MK2WT-Non-Treated.

3 讨论

本研究主要探讨p38MAPK活性调节因子MK2、MK3在支气管炎症中对细胞因子分泌的调节作用及具体机制，通过检测经野生型MK2、MK3腺病毒感染的支气管平滑肌细胞中MK2、MK3的蛋白表达活性，MK2、MK3对细胞因子分泌及对MAPK和NF-κB信号通路的影响，以期为支气管哮喘的治疗提供可靠的理论依据。经腺病毒感染的支气管平滑肌细胞，促炎因子处理后，MK2WT蛋白活性最高，HSP27为磷酸化MK2/MK3的主要底物之一，HSP27的磷酸化水平可反映MK2/MK3的蛋白活性[12]。有文献报道在气道炎症反应时支气管平滑肌细胞可分泌IL-2、IL-5、IL-12[13]。然而在本实验中并未检测到Th1细胞因子包括IL-2、IL-12和Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等的分泌。以上结果说明，促炎因子刺激支气管平滑肌细胞后对Th1/Th2分泌细胞因子没有影响，但可以诱导IL-6、IL-1β、MCP-1/CCL2和RANTES/CCL5的分泌。然而感染腺病毒的支气管平滑肌细胞仅对IL-6和RANTES/CCL5的分泌有影响，不影响MCP-1/CCL2的分泌。MCP-1/CCL2在哮喘患者支气管肺泡灌洗液和血清中显著升高，为过敏性哮喘的潜在生物标志物[7-10]。通过抑制p38MAPK可减弱MCP-1/CCL2的分泌[11]，在本研究中MK2和MK3的过表达还不足以对MCP-1/CCL2的分泌进行调节。

NF-κB信号通路是炎症反应中的重要信号通路，在脂多糖(LPS)、TNF-α单独或联合使用下可被激活[14-17]。车楠等[18]研究显示，抑制P13K/Akt/NF-κB/MMP-9信号通路的传导可发挥对支气管哮喘小鼠气道重构的抑制作用。在本研究中，MK2的过表达抑制NF-κB信号通路的激活，且不受其他细胞因子刺激的影响，然而MK3WT的过表达在促炎因子处理组中可激活NF-κB信号通路。在MAPK信号通路中，经促炎因子刺激后MK2WT组p38MAPK磷酸化水平明显提高，且显著高于MK3WT组，说明MK2WT在MAPK信号通路激活中占主导地位。在MK2缺陷小鼠中，TNF-α、IL-6和IFN-γ分泌减少，而MK3缺陷小鼠中细胞因子的分泌却没有明显的改变[19-20]，因此说明MK2和MK3对细胞因子分泌的影响不同。结合本研究可得知，MK2WT对MAPK信号通路具有调节作用，MK3WT对NF-κB信号通路具有调节作用，可通过靶向MK2WT和MK3WT调节细胞因子的分泌。综上所述，MK2和MK3在支气管平滑肌细胞中通过不同的信号通路调节细胞因子的分泌，通过靶向MKs可调节支气管气道炎症反应，有可能成为治疗支气管气道炎症反应的一种有效方法。