杨梦瑞，简凌波，李鹏，王敏，周剑，王彤彤，张丽媛

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

加替沙星是第四代氟喹诺酮类广谱抗菌药物，具有强大的抗菌效能，是近年来增长迅速的氟喹诺酮类药物代表之一，广泛应用于人类和各种动物疾病的控制、治疗及预防［1-3］。然而，由于养殖过程不规范使用或滥用，容易造成该药物在畜禽、水产等动物产品中残留。虽然我国农业农村部235 号、2292号等公告中明确规定了恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星等氟喹诺酮类药物的禁限用要求，但是加替沙星等新型的氟喹诺酮类药物逃避监管的风险仍然日益增大。目前，虽然已建立了动物源产品中加替沙星残留分析检测方法，但是相关的国家有证标准物质还未见报道。因此研制加替沙星纯度有证标准物质，保证检测数据的量值溯源与准确可靠非常有必要。

纯度有证标准物质主要有两个重要作用，一是配制溶液标准物质，用于仪器校准；二是为复杂样品测量结果赋值，建立计量溯源性，保证测量结果可溯源至SI 基本单位［4-5］。纯度标准物质具有准确性、均匀性、稳定性等主要特征，纯度测量的过程也是给标准物质定值的过程。标准物质的定值通常有绝对权威方法定值、不同原理方法定值、实验室合作定值、比对法定值等几种方式，针对纯度标准物质，目前常见并广泛应用的定值方法主要有质量平衡法、示差量热扫描法、定量核磁法等［6-8］。质量平衡法需要充分考察有机杂质、水分、无机杂质以及挥发性有机杂质对主成分含量的影响，它是一种间接测定主成分纯度的方法，涉及色谱、卡尔费休滴定、顶空气相色谱、ICP-MS／OES、离子色谱、热重分析等多种仪器测定［9］。近年来，随着核磁技术的发展，核磁定量技术也被广泛应用于纯度标准物质定值，该方法快捷、简便，可通过有证标准物质作为内标，将测量结果直接溯源至SI 单位，但是内标物的选取至关重要，首先必须是高纯度有证标准物质，其次与待测物在氘代试剂中不发生反应，第三用于定量的核磁谱峰互不干扰［10-11］。示差量热扫描法是基于Vant Hoff方程的纯度测定方法，但是不适用于热稳定性差的化合物，且易受杂质及样品本身的物理化学性质影响，具有一定的局限性［12］。

笔者针对加替沙星纯度标准物质缺失的现状，选择高纯度纯品原料，根据JJF 1006-1994 《一级标准物质技术规范要求》［13］，采用两种不同原理的方法对加替沙星纯度标准物质定值，基于卡尔费休法和热重分析法准确测量了影响主成分纯度的水分含量。考察了加替沙星纯度标准物质均匀性、稳定性，并评估了标准物质的不确定度。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：2695 型，美国Waters 公司。

核磁共振仪器：Avance III 型，德国Bruker 公司。

卡尔费休水分滴定仪：TOLEDO DL39 型，瑞士Mettler 公司。

热重分析仪：TGA-50 型，日本Shimadzu 公司。

分析天平：XS105 型，瑞士Mettler 公司。

气相色谱仪-氢火焰离子化检测器：Agilent 6890 型，美国Agilent 公司。

加替沙星纯品原料：加拿大TRC 公司。

苯甲酸基准物质：编号为GBW 06117，质量分数为99.993%±0.009%，中国计量科学研究院。

氘代乙酸：纯度99%，美国Sigma-Aldrich 公司。

乙腈、甲醇有机溶剂：色谱纯，德国Merck 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准物质候选物选择

加替沙星纯度标准物质原料来自于市售纯品，产品包装规格为100 g。为了进一步确认原料的准确可靠，分别采用红外光谱法、质谱法等手段对购买的原料进行了主成分定性分析。将经过主成分定性分析且充分混合好的标准物质原料，分装至5 mL洁净样品瓶中，置于洁净干燥器内干燥24 h 后，加盖密封。每个包装量为100 mg，共400 个包装单元。置于4℃冰箱内保存。

1.2.2 定值方法

(1)质量平衡法［14］中主要仪器工作条件。

高效液相色谱仪：色谱柱为Agilent Eclipse Plus SB-Aq 型(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色谱柱；流动相：乙腈-水(0.05 mol／L 磷酸二氢钾溶液-3%磷酸，用三乙胺调节至pH 3.3)(体积比为15∶85)；流量：1.0 mL／min；进样体积：10 μL；紫外检测器：检测波长为291 nm。

卡尔费休法测定水分：采用水分标准物质校准仪器后，称取5～7 mg 待测样品，待滴定结束，记录水分含量。

TGA 法水分测定升温程序：先以5℃／min 匀速升温至105℃，保持5 min，之后继续以5℃／min升温至恒重，记录失重质量分数。

(2)核磁共振定量法。

选择苯甲酸基准物质为内标，将准确称量的加替沙星标准物质与苯甲酸内标物共溶解于1 mL 氘代乙酸溶剂中，待充分溶解后，移取至石英核磁管中，参照文献［15］测定加替沙星的纯度。

1.2.3 均匀性检验

随机抽取15 个包装单元，每个单元取3 个子样，采用液相色谱法测定主成分，同时采用卡尔费休法测定15 个抽取单元中水分含量，主成分扣除水分后进行均匀性检验。测量的数据采用单因素方差分析法进行统计检验，通过比较F检验值与F临界值的大小来判定。

1.2.4 稳定性考察

长期稳定性：在分装储藏后的0、1、3、6 个月抽样测定。

短期稳定性：模拟运输过程温度变化，分别在20、40、60℃条件下监测9 天的稳定性。每个温度时间条件下随机抽取2 个包装，采用液相色谱法测定主成分，平行测定3 次，同时测定每个单元的水分含量，主成分扣除水分后进行稳定性考察，采用趋势分析法评价稳定性监测结果。

2 结果与讨论

2.1 定值研究

采用质量平衡法对经过定性确认分析并分装好的加替沙星纯度标准物质候选物进行纯度定值。基于前期氟喹诺酮类标准物质的研究基础，认为SB-Aq 色谱柱更适用于此类药物纯度标准物质中杂质的色谱响应与分离，因此选择0.3%磷酸溶液与磷酸二氢钾-磷酸(三乙胺，pH 3.3)的缓冲溶液作为水相，乙腈作为有机相，并进一步优化了流动相比例，加替沙星及其杂质的高效液相色谱图见图1。如图1 所示，当有机相与水相比例为15∶85 时，主峰对称性好，图1 中1、2、3、4 均为杂质峰，由图1 可以看出杂质峰充分响应，并且主成分及4 个杂质峰能够很好的实现基线分离，满足面积归一化定值要求。采用上述条件，对随机抽取的7 个单元，测量了加替沙星主成分及结构相似有机杂质的含量。

图1 加替沙星及其杂质的高效液相色谱图

然而，对于药物纯度标准物质，水分含量是影响纯度的关键因素，由于加替沙星具有一定的吸湿性，水分含量的控制与准确测定是该纯度标准物质研制的重要环节。因此本研究重点采用热重分析(TGA)和卡尔费休两种不同原理的方法，对封装好的标准物质候选物中水分含量进行了较为充分的分析与测定。实验采用TGA 法测定水分，结果如图2所示，整个升温过程失重质量6.237%，由图2 中升温曲线的平台部分可以看出，失重基本发生在保持105℃恒温5 min 阶段之前，我们推测失重主要是以水分失去造成的。同时采用了卡尔费休法准确测定了加替沙星纯度标准物质中水分含量，两种方法水分测定结果基本一致，结果表明TGA 法也可用于加替沙星中水分准确测定，实验采用卡尔费休法测定值为水分含量最终结果。采用顶空气相色谱和ICP-MS 分别测量了有机挥发性杂质和无机杂质，结果显示其总含量小于0.014%，对纯度定值结果影响可忽略，不作详细讨论。定值结果如表1 所示，质量平衡法测定的加替沙星纯度值为93.23%。

图2 加替沙星纯度标准物质TGA 曲线图

表1 加替沙星的质量平衡法定值结果 %

综上所述，加替沙星纯度质量分数定值结果为93.1%。

图3 苯甲酸与加替沙星样品的1H-NMR 谱图

表2 加替沙星的定量核磁法(1H-NMR)定值结果 %

2.2 均匀性检验

均匀性检验采用高效液相色谱峰面积归一化法，针对机抽取的样品从1 到15 编号，洁净干燥环境下平衡至室温后，每个单元取3 个子样，分别配制成质量浓度为100 mg／L 的加替沙星甲醇溶液，上机测定。同时采用卡尔费休法测定15 个抽取单元中水分含量。定值结果采用单因素方差分析法进行统计检验［16］,加替沙星均匀性检验结果见表3。

表3 加替沙星纯度标准物质均匀性检验结果 %

2.3 稳定性考察

根据JJF 1343-2012 《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，重点考察了长期保存和短期运输条件下，环境温度对加替沙星纯度标准物质特性量值的影响。由于加替沙星具有较强的吸湿性，因此在稳定性考察时也充分考虑了其中水分含量的变化及其对特性量值的影响。按照先密后疏的原则，长期稳定性分别在第0、1、3、6 个月进行稳定性考察。每次随机抽取2 个包装，采用重量-容量法配制溶液，高效液相色谱法测定主成分含量，每个单元平行测定三次，同时利用卡尔费休法测定每个包装的水分含量。图4 和图5 分别为加替沙星纯度与包装单元内水分含量半年的监测结果。以监测时间和测定结果拟合直线，采用趋势分析法［16］进行稳定性检验，结果见表4。

图4 加替沙星纯度标准物质中加替沙星6 个月稳定性趋势图

图5 加替沙星纯度标准物质中水分含量的6 个月稳定性趋势图

表4 加替沙星纯度标准物质稳定性监测结果 %

由 表4 计 算 得，b1=0.023 1，b0=93.32，s2=0.009 322 70，s(b1)=0.021 069 83，t0.95，n-2=4.3，s(b1)t0.95，n-2=0.090 6。结果：|b1|＜t0.95，n-2s(b1)，无显著性差异。说明6 个月内加替沙星纯度及其包装单元内的水分含量没有明显的变化趋势，稳定性检验合格。

针对短期稳定性考察，为了模拟运输条件，将随机抽取的样品分别置于20、40、60℃的恒温箱中，分别在第1、3、5、7、9 天测定。测定方法与长期稳定性相同，结果见表5～表7。

表5 20℃下加替沙星固体纯度标准物质测定结果

根据表5 数据计算得：b1=-0.037 7，b0=93.516，s2=0.010 629 8，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.051 839 478，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，说明20℃下短期稳定性检验合格。

表6 40℃下加替沙星固体纯度标准物质测定结果

根据表6 数据计算得：b1=-0.012 1，b0=94.17，s2=0.064 093 4，s(b1)=0.040 029 2。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.127 292 8，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，说明40℃下短期稳定性检验合格。

表7 60℃下加替沙星固体纯度标准物质测定结果

根据表7 数据计算得：b1=0.085 9，b0=93.773，s2=0.072 649 5，s(b1)=0.016 301 7。t0.95，n-2=3.18，s(b1)t0.95，n-2=0.135 523 2，|b1|＜s(b1)t0.95，n-2，说明60℃下短期稳定性检验合格。

图6～图8 为不同温度模拟下9 天时间范围内加替沙星纯度值变化。图6 和图7 中替沙星纯度值无明显的变化趋势，图8 显示加替沙星质量分数有升高的趋势。图9 为不同温度条件下水分变化趋势，由图9 可以看出，40、60℃时水分含量随时间变化有显著的降低，推测是由于在较高的温度条件下，加替沙星固体粉末中吸附水挥发所致，进一步揭示了图8 中加替沙星纯度升高的原因。

图6 20 ℃时加替沙星的短期稳定性趋势图

图7 40 ℃时加替沙星的短期稳定性趋势图

图8 60 ℃时加替沙星的短期稳定性趋势图

图9 水分含量的短期稳定性趋势图

综上所述，加替沙星纯度标准物质6 个月长期稳性定良好。短期稳定性在40、60℃条件下，由于水分变化导致加替沙星质量分数有增大的趋势，为了保证量值的准确可靠，应确保将运输温度控制在20℃以下。

2.4 不确定度评定

基于前期研究报道的不确定度评估与计算方法［14］，系统分析与评估了加替沙星纯度标准物质研制过程中的不确定度，结果见表8。加替沙星纯度标准物质纯度值为93.1%，扩展不确定度为0.6%(k=2)

表8 加替沙星纯度标准物质不确定度评估结果 %

3 结语

研制了加替沙星纯度标准物质。该标准物质定值结果准确可靠、一致性好，水分含量稳定，特性量值的均匀性良好，6 个月内稳定性可靠。该纯度标准物质的研制，填补了国内加替沙星纯度标准物质空白，保证了加替沙星相关检测结果的计量溯源性。