张纪文，王露露，李 芳，刘 杏，赵东明，步志高

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

CRISPR-Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）是存在于细菌或古生细菌中的一种抵御外源DNA侵入的适应性免疫反应系统[1]。目前，CRISPR/Cas9作为一种能够对哺乳动物细胞基因组进行精准修饰的技术，被广泛应用在功能性基因的筛选[2]。最近，利用CRISPR/Cas9 高通量筛选技术研究基因功能、基因治疗、药物研发、疾病作用机理和病毒宿主相互作用的关键分子筛选等方面取得了重大进展[3-6]。狂犬病是一种急性致死性的人兽共患传染病；病毒在细胞内寄生，具有严格的嗜神经性[7]。当前尚未见基于CRISPR/Cas9 高通量筛选研究狂犬病病毒（RV）感染神经细胞的报道，因此本研究构建稳定表达Cas9蛋白的N2a-Cas9 单克隆细胞系，为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量筛选技术探究神经细胞内关键宿主基因调控RV 嗜神经性提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与细胞株人胚胎肾细胞（Human embo⁃rynic kidney cell，HEK293T）、鼠神经瘤母细胞（N2a）细胞株由本实验室保存。LentiCas9-Blast 质粒、pXPR-011 质粒、慢病毒pMD2.G、pSPA X2 骨架质粒购自Addgene 公司。

1.2 主要试剂大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；兔源Cas9 单克隆抗体（MAb）和HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体（IgG-HRP）购自Abcam 公司；Polybrene、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、Puromycin 购自Sigma 公司；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 购自Promega 公司；TransIT®-Len⁃ti Transfection Reagent 购自Mirus 公司。

1.3 慢病毒的包装和感染剂量的确定按照TransIT®-Lenti Transfection Reagent 说明书方法，将LentiCas9-Blast、pMD2.G 和pSPA X2 共 转 染 至HEK-293T，包装慢病毒。72 h 后收集慢病毒上清液并离心，再用0.45 μm 滤器过滤。将慢病毒按照不同剂量（320 μL、160 μL、80 μL、40 μL、20 μL、10 μL、5 μL）感染N2a 细胞，设不加慢病毒及无杀稻瘟菌素的细胞对照组。慢病毒感染24 h 后，换为含有20 μg/mL 杀稻瘟菌素的完全培养基。……