沈永华，程泽星，汪峻峰，王敏

扬州大学附属医院，江苏扬州225000

鼻咽癌是一种源于鼻咽部上皮细胞的头颈部肿瘤，常伴有早期远处转移和局部侵袭，主要发生在中国南部和东南亚［1］。Epstein-Barr 病毒感染、肿瘤抑制因子、癌基因和环境因素等与鼻咽癌的发生有关，但其发病机制仍有待完全阐明［2］。尽管过去几十年治疗措施有了很大改善，但鼻咽癌的5 年生存率仍然很低［3］。因此，探索鼻咽癌的发病机制对于确定最佳治疗策略至关重要。微小RNA（miRNA）是一类由19～25 个核苷酸组成的小的非蛋白质编码RNA，其可通过与靶mRNA 的3"非翻译区（3"UTR）配对结合来抑制转录后水平靶基因的表达。在各种人类癌症的发生和发展过程中，表达失调的miRNA可作为致癌基因或肿瘤抑制因子发挥作用［4］。miR⁃NA 在鼻咽癌许多关键生物过程中发挥重要的调节作用，如细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、放射敏感性和化学敏感性［5-6］。研究发现，miR-363-5p 在多种癌症包括肝细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌等中起肿瘤抑制剂的作用［7-9］。CHAPMAN 等［10］报道 miR-363 靶向肌球蛋白1B 以减少头颈癌中的细胞迁移。但miR-363-5p 在鼻咽癌中的作用及分子机制尚不十分清楚。因此 2018 年 4—10 月，本实验检测了 miR-363-5p 在不同鼻咽癌细胞中的表达情况，观察了miR-363-5p对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响，并对其潜在的分子机制进行初步探讨，以期为鼻咽癌的治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常鼻咽上皮细胞NP-69 及鼻咽癌细胞 5-8F、CNE1、CNE2Z 和C666-1 均购于中国科学院上海细胞库；miR-363-5p mimics 及阴性对照购于广州锐博生物科技有限公司；DMEM 培养基购于美国Sigma 公司；胰蛋白酶及胎牛血清购于美国Gibco公司；青—链霉素双抗购于杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA 提取试剂、MTT 试剂及脂质体Lipofectamine2000 转染试剂购于美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR 检测试剂盒购于大连宝生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 双染色细胞凋亡检测试剂盒购于日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于北京普洛麦格生物技术有限公司，荧光素酶报告重组载体由该公司完成；Bax一抗、Cleaved Caspase-3一抗及BRD4一抗购于美国CST 公司；GAPDH 一抗及辣根过氧化酶标记的IgG 购于美国Santa cruz 公司；实验所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养和转染 将人正常鼻咽上皮NP-69细胞及鼻咽癌5-8F、CNE1、CNE2Z 和 C666-1 细胞培养在含10%灭活胎牛血清、100 U/mL 青—链霉素双抗的DMEM 培养基中，置5%CO2、37 ℃培养箱中，及时更换新的培养液，每隔2 d 传代1 次，取对数生长期的细胞用于实验。将对数增殖期的鼻咽癌5-8F细胞以3×103个/孔种植到6 孔板中，过夜培养，待细胞生长密度至50%左右时根据Lipofectamine2000转染试剂使用手册进行转染，将转染miR-363-5p mim⁃ics的5-8F细胞作为miR-363-5p组，转染阴性对照的5-8F 细胞作为NC 组，未进行转染处理的5-8F 细胞作为Control 组。各组5-8F 细胞转染6 h 后更换为含10%胎牛血清的DMEM 培养液，在37 ℃培养箱中继续培养48 h。

1.3 细胞中miR-363-5p 检测 采用qRT-PCR。处于对数生长期的正常鼻咽上皮细胞NP-69 及鼻咽癌细胞5-8F、CNE1、CNE2Z和C666-1分别使用RNA提取试剂提取总RNA，采用同样的方法提取转染48 h 后各组5-8F 细胞中总RNA。分别检测RNA 的纯度和浓度，取合格的总RNA 1µg以逆转录试剂盒进行cDNA 合成，调整cDNA 浓度，使用荧光定量PCR检测试剂盒，以U6 为内参进行PCR 扩增，反应体系：cDNA 2 µL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 µL，上下游引物分别1 µL，ddH2O 6 µL。qRT-PCR 实验所用 引 物 U6 F：5"-GCTTCGGCAGCACATATACTA⁃AAAT-3"，R：5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；miR-363-5p F：5"-GGTCCAGATCTACATGCGT-3"，R：5"-CAGTCGTTGCGGGTGAGT-3"。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40 个循环。反应结束后获取实验数据以2-ΔΔCt法计算各细胞中miR-363-5p的相对表达量。

1.4 细胞增殖能力检测 采用MTT 实验。取对数期的5-8F 细胞，以胰蛋白酶消化，收集细胞并制成细胞悬液，接种到96 孔板中，接种密度为1×103个/孔。待细胞生长密度在50%时以1.2方法进行转染和分组，分别在24、48、72 h 时向各孔细胞加入MTT检测液100µL，充分混匀后在37 ℃下继续孵育4 h，再加入150µL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡反应至沉淀充分溶解，在酶标仪450 nm 波长处测定各孔细胞光密度值（OD 值），实验重复3 次。以OD 值代表细胞的增殖能力。

1.5 细胞凋亡率检测 采用Annexin V/PI 双染色。取转染48 h 后各组5-8F 细胞，以胰酶消化，离心并收集约1×104个细胞。加入Binding buffer 结合缓冲液100µL 悬浮细胞，向细胞悬液中加入Annexin VFITC 溶液5µL，混匀后孵育5 min，再向细胞中加入PI 染液5 µL，轻轻混匀，室温避光反应15 min，立即上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.6 miR-363-5p 与BRD4 表达关系验证 采用双荧光素酶报告基因实验。使用生物信息学在线数据库TargetScan 等预测miR-363-5p 的靶基因，结果显示BRD4 3"UTR 与miR-363-5p 存在靶向结合位点，提示BRD4 可能是miR-363-5p 的直接靶基因。分别扩增并构建含野生型BRD4 3"UTR（BRD4-Wt）及突变型BRD4 3"UTR（BRD4-Mut）的荧光素酶重组载体，该部分由北京普洛麦格生物技术有限公司完成。将BRD4-Wt 或BRD4-Mut 重组载体分别与miR-363-5p mimic 及阴性对照共转染5-8F 细胞，48 h 后使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性，计算细胞相对荧光活性，实验重复3次。

1.7 Bax、Cleaved Caspase-3 和 BRD4 蛋白检测 采用Western blotting 法。转染48 h各组5-8F细胞以胰酶消化，收集细胞并提取总蛋白，使用BCA 蛋白浓度检测试剂盒对蛋白样品进行定量，取等量蛋白加入到上样孔，行SDS-PAGE 电泳，蛋白分离后转印至PVDF 膜上，在封闭液中室温孵育1 h，TBST 洗膜后分别加入相应一抗［Bax 一抗（1∶800），Cleaved Cas⁃pase-3 一抗（1∶800），BRD4 一抗（1∶500）］，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后再加入1∶3 000稀释的二抗，室温孵育2 h。TBST 洗膜后使用ECL 显影液进行显影，在凝胶成像系统中成像拍照，以GAPDH 用于蛋白的内参对照，采用ImageJ 软件分析目的蛋白相对表达量，实验重复3次。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各种细胞中miR-363-5p 表达比较 正常鼻咽上皮细胞NP-69 及鼻咽癌细胞5-8F、CNE1、CNE2Z、C666-1 中miR-363-5p 的相对表达量分别为1.00 ±0.10、0.16 ± 0.02、0.38 ± 0.04、0.40 ± 0.04 和0.62 ± 0.06，与 NP-69 相比，5-8F、CNE1、CNE2Z 和C666-1 中 miR-363-5p 的表达下调（P均<0.05）。鼻咽癌细胞5-8F 中miR-363-5p 的相对表达量最低，因此选其作为后续实验的研究对象。

2.2 鼻咽癌5-8F 细胞转染miR-363-5p mimics 效果检测 Control 组、NC 组和 miR-363-5p 组 5-8F 细胞中miR-363-5p 的相对表达量分别为1.00 ± 0.11、0.99 ± 0.10、3.02 ± 0.33，miR-363-5p 组 miR-363-5p表达低于NC组（P<0.05），而Control组和NC组比较差异无统计学意义。

2.3 过表达miR-363-5p 对5-8F 细胞增殖能力的影响 miR-363-5p 组5-8F 细胞增殖能力低于NC 组（P<0.05），而Control 组和NC 组比较差异无统计学意义。见表1。

表1 过表达miR-363-5p对5-8F细胞增殖能力的影响（±s）

表1 过表达miR-363-5p对5-8F细胞增殖能力的影响（±s）

注：与NC组相比，*P<0.05。

组别Control组NC组miR-363-5p组F P细胞增殖能力24 h 0.26±0.02 0.25±0.02 0.20±0.02*23.250<0.01 48 h 0.58±0.06 0.55±0.05 0.32±0.03*78.043<0.01 72 h 0.76±0.08 0.75±0.07 0.40±0.04*87.977<0.01

2.4 过表达miR-363-5p对5-8F细胞凋亡的影响miR-363-5p 组、Control 组、NC 组细胞凋亡率分别为（23.75 ± 5.28）%、（7.04 ± 2.16）%、（7.33 ± 2.46）%，miR-363-5p 组高于 NC 组（P<0.05），而 Control 组和NC 组比较差异无统计学意义。miR-363-5p 组5-8F细胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达高于NC组（P均<0.05），而 Control 组和NC 组比较差异均无统计学意义。见表2。

表2 过表达miR-363-5p对5-8F细胞Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响（±s）

表2 过表达miR-363-5p对5-8F细胞Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响（±s）

注：与NC组相比，*P<0.05。

组别Control组NC组miR-363-5p组F P Bax蛋白0.33±0.04 0.35±0.04 0.67±0.07*121.333<0.01 Cleaved Caspase-3蛋白0.16±0.02 0.15±0.02 0.71±0.07*486.474<0.01

2.5 miR-363-5p 与 BRD4 表达的关系 miR-363-5p mimics、阴性对照与BRD4-Wt共转染细胞相对荧光活性分别为1.00±0.10、0.31±0.03，两者相比P<0.05；miR-363-5p mimics、阴性对照与 BRD4-Mut共转染细胞相对荧光活性［（1.00± 0.09）vs（0.98±0.09）］比较差异无统计学意义。miR-363-5p组5-8F细胞中 BRD4 蛋白表达（0.32 ± 0.03）低于 NC 组（0.14 ± 0.01），P<0.05。

3 讨论

miRNA 作为重要的调节因子，已被证明在多种肿瘤的各种恶性生物学行为中起关键作用，包括鼻咽癌的增殖和凋亡。据报道，miRNA 通过靶向不同的基因或信号通路在鼻咽癌及其预后中起重要作用，如 miR-23a、miR-379、miR-142、miR-26a 和 miR-141 等［11-13］。miR-363 在多种癌症中显著下调，起肿瘤抑制因子的作用。本研究发现miR-363-5p 在鼻咽癌细胞系中的表达低于正常鼻咽上皮细胞，与先前 CHEN 等［14］报道中的趋势相符。WANG 等［15］研究发现，miR-363-3p 通过靶向肺腺癌中增殖细胞核抗原的表达抑制肿瘤生长。在骨肉瘤组织中miR-363-3p 表达下调，过表达miR-363-3p 可通过靶向调控SOX4 的表达显著抑制骨肉瘤U2OS 和MG63 细胞的增殖、迁移和侵袭［16］。在肝癌细胞中，miR-363 通过直接靶向E2F 转录因子3 的表达来抑制肝细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭［17］。ZHANG 等［18］报道 hsamiR-363-5p的低表达与肝细胞癌患者的总体存活呈负相关，提示miR-363-5p 可能是肝细胞癌的潜在预后标志物。此外，miR-363 介导的HMGA2 表达负向调节非小细胞肺癌的发生和进展［19］。为了深入了解miR-363-5p 在鼻咽癌发病机制中的作用，本实验分析了miR-363-5p 对鼻咽癌5-8F 细胞增殖和凋亡的影响，结果发现miR-363-5p 过表达能够抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。众所周知，促凋亡蛋白Bax 属于Bcl-2家族的成员，其在凋亡过程中调节线粒体功能。当细胞处于应激状态时，会发生膜变化，从而导致凋亡因子释放到细胞质中，包括细胞色素C。细胞色素C 的增加会激活caspase-3，导致细胞凋亡加速。本实验结果显示，miR-363-5p 过表达能够促进Bax和Cleaved Caspase-3的表达，表明miR-363-5p过表达可通过上调Bax 和Cleaved Caspase-3 的表达促进细胞凋亡。以上这些结果表明miR-363-5p 在鼻咽癌中可能发挥肿瘤抑制的功能。

miRNA 通常通过碱基配对与其靶基因相互作用来发挥其功能。本研究前期预实验通过生物信息学手段预测发现BRD4 是miR-363-5p 的直接靶基因。双荧光素酶报告基因实验验证了BRD4是miR-363-5p 靶基因。BRD4 属于两个串联溴结构域和含有额外末端结构域的家族蛋白，它们已成为基因转录和癌症发展的重要表观遗传调节因子。BRD4 可通过调节癌症促进因子的表达和活性来调节癌细胞的多种特性，包括细胞增殖、凋亡、转化、侵袭和耐药性［20］。BRD4 在多种实体瘤包括胰腺癌、乳腺癌和结肠直肠癌等中过表达，BRD4 的表达抑制能够阻碍这些癌细胞增殖和侵袭［21-23］。目前BRD4 已成为癌症治疗中有前景的治疗靶点［24］。SHEN 等［25］通过体内及体外实验证实，BRD4 表达抑制可抑制人前列腺癌细胞的生长。在甲状腺癌组织中BRD4 的表达明显高于对应癌旁组织，沉默BRD4 后能够抑制甲状腺癌 TPC-1 细胞的增殖、活力、侵袭和迁移［26］。BRD4 特异性抑制剂GSK525762A 能够抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖和侵袭，并诱导CNE-2细胞凋亡［27］。本实验结果显示，过表达miR-363-5p 鼻咽癌5-8F 细胞中BRD4 的表达降低，提示miR-363-5p 能够负向调控BRD4的表达。

综上可见，miR-363-5p 对鼻咽癌细胞的增殖有一定的抑制作用，并可促进细胞凋亡；miR-363-5p可能通过靶向负调控BRD4 参与鼻咽癌的调控机制。但miR-363-5p 在鼻咽癌中的具体作用机制仍需深入探究，后续实验将在多株鼻咽癌细胞及动物模型中进一步探讨。