马成斌，刘平，刘彧，张文缨，王朝

上海市长宁区妇幼保健院，上海200051

子宫内膜癌（EC）是女性生殖系统常见的高恶性妇科肿瘤之一［1］。经统计分析，在我国大部分地区，EC 的发病率明显高于宫颈癌，已成为女性生殖系统的主要癌症［2］。尽管EC 的总体预后相对良好，但EC 发病率呈上升趋势［3］。子宫内膜样腺癌（EEC）占所有EC 病例的80%，主要采取手术联合辅助放疗、化疗或激素治疗，而对于晚期或复发的EEC患者，常规放疗和化疗效果不佳［4］。EEC 发生的分子机制非常复杂，涉及一系列基因和蛋白质的表达异常。近年来，国内外EEC 发病率均呈上升趋势，其预后较差，预后的改善依赖于早期诊断。然而，EEC 的早期诊断困难，尚缺少高敏感性和特异性的肿瘤标志物。microRNA（miRNA）是真核生物中广泛存在的由19～25个核苷酸组成的小分子非编码单链RNA，目前研究已经发现超过50%的miRNA位于肿瘤相关基因组区域，对癌症发生发展有重要的影响［5］。研究表明，在一些肿瘤组织中异常表达的miRNA 参与肿瘤的癌变过程，其作用类似于癌基因或抑癌基因，参与调控癌细胞增殖、凋亡、分化和迁移等重要生物学过程［6-7］。同样，在 EEC 中，大量miRNA，如 hsa-miR-30c、hsa-miR-23a 以及 hsa-miR-199a-3p 已被报道通过调控多种信号通路和关键的靶点基因调控EEC 细胞的生长及迁移，从而影响EEC的癌变进程［8-11］。因此，初步筛选和鉴定EEC组织中显著差异表达的miRNA，并分析其与患者预后高危因素的关系，对进一步研究miRNA 作为EEC 早期诊断和预后评估的分子标志物具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 氯仿和异丙醇购自上海化学试剂有限公司；miRNA 表达谱芯片购自美国Illumina公司；miRNA 芯片试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；Gene Pix 4000B 芯片扫描仪购自美国Axon公司；TRIzol 试剂购自日本 TaKaRa 公司；SuperscriptⅡreverse transcription 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；SYBR Premix Ex Taq ⅡTM试剂盒购自日本TaKa⁃Ra 公司；PCR 扩增仪购自美国 BioRad 公司；EP 管购自德国Sarstedt公司；DEPC水购自北京索莱宝公司；低温离心机购自德国Sigma公司。

1.2 样本来源 收集本院2017 年7 月—2019 年7月手术的79 对EEC 患者冰冻癌组织和邻近正常子宫内膜组织标本。所有患者在手术前未接受放疗、化疗和激素治疗，并签署知情同意书。标本采集获得医院伦理委员会审查批准。其中3 对样品用于miRNA 表达谱芯片分析；17对样品用于qRT-PCR 验证芯片提示显著变化的miRNA 表达；该标本来源的20 例患者的年龄为（53.8 ± 1.3）岁，FIGO 分期Ⅰa、Ⅰb 期，组织分化 G1、G2 级。其他 59 对样品用于qRT-PCR 验证下调最明显的miRNA 的表达，标本来源的 59 例 ECC 患者≤60 岁 35 例（59.3%），>60 岁 24例（40.7%）；绝经前 10 例（16.9%），绝经后 46 例（77.9%）；手术病理分期Ⅰ期46 例（77.9%），Ⅱ期6例（10.2%），Ⅲ期7 例（11.9%）；组织分化G1 级23例（39.0%），G2 级 26 例（44.1%），G3 级 10 例（16.9%）；肌层浸润深度≤1/2 47例（79.7%），肌层浸润深度>1/2 12 例（20.3%）；有淋巴结转移 7 例（11.9%），无淋巴结转移52例（88.1%）；有脉管浸润16例（27.1%），无脉管浸润43例（72.9%）。

1.3 组织样本RNA 提取 将新鲜的EEC 组织及相对应的邻近正常子宫内膜组织浸没于液氮中保存。进行样本RNA 提取时，将组织样本置于冰上研磨，并加入TRIzol 和氯仿。随后，将研磨组织转移至EP管中，于3 000 r/min 低温离心10 min。离心结束后，将上清转移至新的EP 管，同时加入等体积异丙醇。再次离心后弃去上清，获得沉淀于EP 管底部的RNA。之后将1 mL 75%乙醇加入EP 管中，震荡混匀，悬浮沉淀。待乙醇挥发晾干，利用DEPC 水溶解RNA 样品，并利用生物分光光度计测定RNA 样品浓度。

1.4 miRNA 差异表达谱分析 对提取的RNA 浓度及纯度进行检测，A260/A280在 1.8～2.1 被认为 RNA 纯度符合实验标准。随后，利用离心过滤器分离10µg总RNA，并从中获得miRNA。在HiSeq测序后，完成去除接头和去除低质量和污染等过程，数据预处理获得干净序列。然后，统计序列长度的分布情况，以及样品间公共序列。将预处理获得的干净序列进行分类和注释，得到样品表达信息后，利用剩余未注释片段进行miRNA 的预测分析。随后，采用Gene Pix 4000B 芯片扫描仪采集图像，并利用配套分析软件进行数据处理，最终筛选出差异表达的miRNA。相对于邻近正常子宫内膜组织，将癌组织中miRNA 表达≥1.5 倍的定义为上调，<1.5 倍的定义为下调。

1.5 差异表达的miRNA 检测 利用qRT-PCR对差异变化明显的miRNA 芯片结果准确性进行进一步验证。构建20 µL qRT-PCR 反应体系，其中包含 10 µL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）、0.8 µL PCR Forward Primer（10 µmol）、0.8 µL PCR Reverse Primer（10 µmol）、0.4 µL ROX Ref⁃erence Dye Ⅱ（50×）、2 µL DNA 模板以及 6 µL ddH2O。将上述反应体系加入PCR 仪上，并按照95 ℃ 30 s、95 ℃ 3 s、61 ℃ 30 s循环40次的反应条件进行。U6 为内参基因，其引物序列U6 GSP（对应miRNA 的特异引物）为 5"-GCTTCGGCAGCA⁃CATATACTAAAAT-3"，R 为 5"-GTGCAGGGTCC⁃GAGGT-3"，退火温度60 ℃，产物长度89 bp。另外，hsa-miR-369-3p 的引物 序列 hsa-miR-369-3p GSP 为5"-GGGCTGGGAGAGGGTTGTTT-3"，R 为 5"-GTG⁃CAGGGTCCGAGGT-3"，退火温度 60 ℃，产物长度59 bp。采用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；miRNA 与患者预后高危因素之间的关系采用非参数检验方法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EEC 组织中miRNA 基因芯片表达谱 聚类分析图显示冰冻EEC 组织与邻近正常子宫内膜组织比较存在40 个差异表达的miRNA（图1）。对miR⁃NA 表达谱芯片进行预处理和数据分析后，得到8 个具有代表性的差异表达的miRNA；5 个下调的miR⁃NA，分别为 hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsamiR-451a、hsa-miR-493-5p 和 hsa-miR-543；3 个上调的 miRNA，分别为 hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p和 hsa-miR-145-5p。其中，hsa-miR-369-3p 下调最为明显。见表1。

表1 EEC组织中8种显著差异miRNA的表达

2.2 qRT-PCR验证芯片筛选的异常变化的miRNA表达结果 与邻近正常子宫内膜组织相比，EEC组织中hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-5p 表达差异倍数分别为6.50±0.09、2.70±0.16、5.60±0.22，表达上调；hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsamiR-451a、hsa-miR-493-5p和hsa-miR-543表达差异倍数分别为 0.133 ± 0.012、0.268 ± 0.020、0.372 ±0.009、0.179±0.011、0.222±0.014，表达下调。qRTPCR验证结果和miRNA测序结果一致。其中，hsa-miR-369-3p下调最明显，被选为进一步研究的miRNA。

2.3 hsa-miR-369-3p表达与EEC患者预后高危因素的关系 EEC 组织中hsa-miR-369-3p 相对表达量为0.233 ± 0.175，较邻近正常子宫内膜组织下降（P<0.05）。EEC组织中hsa-miR-369-3p的表达与手术病理分期、组织分化、淋巴结转移、脉管浸润有关（P均<0.05），见表2。

图1 EEC组织中差异表达miRNA的聚类分析

表2 hsa-miR-369-3p的表达与EEC患者预后高危因素的关系（-x± s）

3 讨论

EC是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一，近年来世界范围内发病率有所增加，该病常见于绝经后妇女，但生育年龄女性亦可发生［12-14］。EC 的 5 年生存率与手术病理分期以及影响预后的高危因素息息相关。有数据表明，早期EC患者经过标准化治疗后5 年生存率超过90%。相反，如果EC 发病程度达到Ⅲ、Ⅳ期，5 年生存率则降低为15%。常规的手术治疗未能降低晚期EC的病死率［15］。EEC是EC中最为常见的类型，早期诊断仍是降低该病病死率的主要手段。但是，目前临床仍缺少灵敏度高和特异性强的早期ECC 诊断及评估预后的分子标志物。因此，有必要研究新的生物学标志物来预防、早期诊断和评估ECC的进展。

人类基因组包含超过上千种miRNA，每种miR⁃NA可调节数百种转录物，总数约为所有基因的三分之一。这些miRNA 可以在不同肿瘤类型中上调或下调，发挥潜在肿瘤抑制剂或促进癌症因子的作用［16-18］。目前，越来越多的研究发现，miRNA 表达谱在肿瘤发生发展过程中会发生异常，因而有望成为肿瘤早期诊断和预后判断的分子标志物［19-20］。在EEC 研究领域，WU 等［21］使用 miRNA 表达谱分析 10对EEC 和邻近的非肿瘤子宫内膜中miRNA 的表达谱，结果显示，在EEC组织中，17种miRNA的表达高于非肿瘤样本，6种miRNA 的表达低于非肿瘤样本；其中，hsa-miR-205、hsa-miR-449 和 hsa-miR-429 在腺癌组织中显著上调，而hsa-miR-204、hsa-miR-99b 和hsa-miR-193b 显著下调。另外，DEVOR 等［22］利用microRNA 表达谱及 qRT-PCR 分析了 EEC 和浆液性腺癌中异常表达的miRNA，结果显示，与正常子宫内膜相比，7 种miRNA 在EEC 和浆液性腺癌中低表达，13 种 miRNA 高表达；其中，miRNA 相对表达最低的为hsa-miR-133b，最高的为hsa-miR-205。本研究为进一步揭示EEC 中miRNA 表达谱的变化，使用基因芯片技术分析了3对冰冻EEC 组织和邻近正常子宫内膜组织中miRNA 的表达谱改变。结果显示，EEC 组织中有8 种miRNA 的表达发生了显著变化，其中 5 种 miRNA 的表达下调，3 种 miRNA 的表达上调。经qRT-PCR 进一步验证基因芯片结果发现，miRNA 表达谱改变结果一致，其中hsa-miR-369-3p下调最为明显。本研究与前述研究结果相似，而且还发现了很多先前未报道的miRNA。该项研究丰富了 EEC 的 miRNA 差异表达谱系，为 miRNA 与EEC 癌变的关系提供了新的实验依据。此外，本研究使用的基因芯片技术可以准确、快速定量检测人类体内成熟的miRNA 的表达量，与传统的Northern杂交等技术相比，该方法不需要接触放射性同位素，且所需要的样品量相对较少，检测范围广［23-24］。

既往研究报道，hsa-miR-369-3p 参与调控多种人类疾病。在非肿瘤领域，一项miRNA 微阵列分析和miRNA-Seq 研究结果显示，银屑病患者血清和病变组织中hsa-miR-369-3p 的表达高于正常患者，而且hsa-miR-369-3p 表达和银屑病疾病活动度呈正相关［25］。AGARWAL 等［26］研究提示，hsa-miR-369-3p上调通过靶向SOX4 抑制先天性巨结肠细胞的迁移和增殖。在肿瘤领域，有研究采用非洲绿猴肾细胞VERO 细胞株作为研究miRNA 的致瘤性作用的对象，发现多个miRNA 和VERO 细胞成瘤特征的发生相关，其中包括 hsa-miR-369-3p［27-28］。另有研究证实，hsa-miR-369-5p 可以作为肝细胞癌早期诊断的血清标志物［29］。在恶性胶质瘤患者中，hsa-miR-369-3p 的表达发生变化，这种变化与患者总生存率密切相关［30］。一项来自 LIU 等［31］的研究显示，hsa-miR-369-3p 在EEC 中表达下调，并且通过自噬作用靶向ATG10 抑制细胞增殖和迁移。本研究发现，hsamiR-369-3p 在EEC 组织中的表达低于正常子宫内膜组织，该结果与LIU 等［31］研究一致。更重要的是，本研究发现，随着手术病理分期增加、组织分化差、淋巴结转移和脉管间隙浸润，hsa-miR-369-3p 的表达下调。推测hsa-miR-369-3p 可能作为抑癌基因参与EEC 的发生、发展和转移，有可能成为EEC 患者预后评价指标。

综上所述，本研究利用芯片技术及qRT-PCR 技术筛选出EEC 中差异表达的miRNA，hsa-miR-369-3p在EEC 组织中表达下调最显著，与EEC 患者预后高危因素密切相关。这些发现不仅有助于加深对EEC 发生发展机制的理解，同时也为hsa-miR-369-3p 作为EEC 候选生物标志物以及潜在基因治疗方案提供了支持性证据。后续实验将针对hsa-miR-369-3p在EEC中具体地调控作用进行进一步探究。