杨卓滢 赵源征 何远宏 孙若楠 苑和平

郑州大学第五附属医院神经内科（郑州450052）

脑梗死是目前导致全球人口死亡的主要原因之一，其特点是高发病率、高致残率和高病死率等。目前脑梗死的主要治疗仍然是超早期的溶栓治疗，条件有限且时间窗严格，只有少数病人能得到治疗［1-2］。因此很多脑梗死患者都遗留有不同程度的神经功能缺失，此时机体出现代偿机制，使得功能恢复，其中突触可塑性的作用，尤为关键。突触素（synaptophysin，SYP）是一种特异性的位于突触囊泡膜上的蛋白，它参与突触发生。生长相关蛋白43（growth associated protein 43，GAP43）是一种胞膜磷酸蛋白，由神经元胞体合成，主要集中于生长锥末端，促进轴突再生，且具有轴突导向作用，二者都是突触可塑性标志物［3-4］。

KATP 通道是一种ATP 敏感型钾离子通道，广泛遍布于大脑区域，脑梗死时，人体处于缺氧或营养物质输送不足的病理状态，ATP 水平降低，KATP 通道被激活，进而可通过抑制细胞凋亡，减少兴奋性毒性，减少钙超载和调节氧化应激来减少损伤［5-7］。因此，KATP 通道可能是治疗脑梗死的重要治疗靶点。尼可地尔，化学名为N⁃（2⁃羟乙基）⁃烟酰胺硝酸盐酯，是首个应用于临床的KATP通道开放剂，有研究表明，尼可地尔对血管性痴呆、亨廷顿病有改善作用［8-9］。也有研究证明，在脑梗死中，尼可地尔可以通过增加脑血流量，减轻炎症等来减轻脑损伤［10］。然而，尼可地尔对脑梗死后突触可塑性方面的作用尚不清楚。

本研究采用大鼠MCAO 模型，通过研究尼可地尔对脑梗死后突触形成相关因子SYP 和GAP43表达的影响，来探讨其作为脑梗死治疗靶点的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂选取SPF 级雄性SD 大鼠（200 ～240 g，6 ～8 周龄），购于郑州大学动物实验中心。所有老鼠饲养于（22±1）℃的恒温条件下，自由饮食。试剂：尼可地尔（北京四环科宝制药有限公司，中国），尼氏染液（北京索莱宝科技有限公司，中国），SYP、GAP43 及GAPDH 引物合成（上海生工生物工程有限公司，中国），兔抗SYP（abcam，美国），兔抗GAP43（abcam，美国），山羊抗兔二抗（abcam，美国），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（上海生工生物工程有限公司，中国）。

1.2 模型制备与分组根据完全数字随机表法将大鼠分为三组：假手术+溶剂组，脑梗死+溶剂组和脑梗死+尼可地尔组，每组34 只。造模后，脑梗死+尼可地尔组大鼠行尼可地尔灌胃处理，剂量为7.5 mg/（kg·d）。另外两组给予等量生理盐水。模型制备：采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）给予大鼠腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定，在显微镜下分离右侧颈总动脉和颈内外动脉，结扎颈总动脉，在动脉间剪一小口，用线栓插至大脑中动脉起始段，长度约（20.0± 2.0）mm。固定线栓，缝合结扎。1.5 h后移除线栓。假手术组大鼠线栓插入大脑中动脉起始段后，立马拔出。其余操作同脑梗死组［11］。采用Zea⁃Longa 评分法评估模型，1 ～3 分视为造模成功，将评分为0 或4 分的大鼠剔除。

1.3 尼氏染色术后第7 天，脑梗死+溶剂组和脑梗死+ 尼可地尔组各取6 只大鼠，深度麻醉后，经PBS、4%多聚甲醛灌注后，取脑，置于4%多聚甲醛过夜，后于30%蔗糖中脱水至沉底，包埋，切成20 μm 的冰冻切片。切片置于载玻片上，进行尼氏染色［12］。计算公式为：脑梗死体积百分比=［（左侧体积⁃右侧非梗死体积）/左侧体积］×100%。

1.4 神经功能评分采用改良神经功能评分（modified neurological severity scores，mNSS）法［13］，脑梗死+溶剂组和脑梗死+尼可地尔组各取8 只大鼠，在造模后1、3、7、14 天，进行神经功能缺损的评估。评分为0 ～18 分，评分越高，代表神经功能缺损越严重。

1.5 水迷宫术后9 ～14 d采用Morris水迷宫对大鼠进行学习记忆能力测试［14］。圆形水池高50 cm，直径150 cm，深30 cm，水温20 ～22 ℃，水池等分为四个象限，圆形逃逸平台（直径12 cm）没入第三象限中央水平面下2 cm。在前五天，每只大鼠被随机置于其中一个象限放入水中，记录在120 s 内大鼠找到隐藏平台的时间，若大鼠120 s 内未找到平台，则引导其到平台并停留10 s，逃逸潜伏期被记录为120 s，测试每天1 次。第14 天将隐藏的平台移开，进行空间探索试验，大鼠从第一象限同一入水点下水，记录大鼠在120 s 内停留在原平台象限的时间。

1.6 RT⁃PCR分别于术后第7 天和14 天检测海马区GAP43 和SYP 的mRNA 表达。取脑梗侧海马区组织于液氮中快速研磨，采用Trizol 试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA 水平，逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，后进行扩增反应［15］，设计产物见表1。PCR 产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，以GAPDH 作为内参，紫外灯下摄像并分析各组间SYP、GAP43 的相对表达量。

1.7 Western blot分别检测手术后7 天和14 天海马区GAP43 和SYP 的蛋白表达，取脑梗侧海马区组织［16］，与适量组织裂解液充分混匀后，置于匀浆机上充分匀浆后离心（4 ℃，14 000 r/min）。吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。BCA 法测总蛋白含量，用12%SDS⁃PAGE 凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h 后，加入兔抗大鼠SYP 一抗（1∶20 000），或兔抗大鼠GAP43 一抗（1∶1 000），4 ℃冰箱过夜。TBST 漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，把GAPDH 作为内参，用ECL 发光法查看条带情况。使用ImageJ 软件量化条带光密度。

1.8 统计学方法数据使用SPSS 22.0 统计软件进行分析。所有数据采用均数±标准差表示。脑梗死体积比较采用t检验，mNSS 评分及水迷宫结果比较采用重复测量方差分析，各组大鼠SYP 和GAP43 的PCR 以及Western blot 结果比较采用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

图1 各组大鼠脑梗死体积、神经功能缺损评分分析结果Fig.1 Results of cerebral infarction volume and neurological deficit score of rats in each group

2.1 尼可地尔对脑梗死大鼠梗死体积以及mNSS评分的影响尼氏染色结果显示，脑梗死+尼可地尔组脑梗死体积［（15.77 ± 4.25）%］较脑梗死+溶剂组［（31.23 ± 3.16）%］明显减少，差异有统计学意义（t= 7.16，P< 0.05，见图1A）。神经功能评分结果显示，术后第3、7、14 天，脑梗死+尼可地尔组的评分明显低于脑梗死+溶剂组，尼可地尔显著改善脑梗死大鼠的神经功能缺损，差异有统计学意义（F=13.847，P<0.05，见图1B）。

2.2 各组大鼠水迷宫试验结果脑梗死+溶剂组大鼠逃逸潜伏期的下降情况整体高于假手术+溶剂组和脑梗死+ 尼可地尔组（P< 0.05，见图2A）；脑梗死+ 溶剂组大鼠的停留时间较假手术+溶剂组明显减少，脑梗死+ 尼可地尔组大鼠的停留时间较脑梗死+ 溶剂组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05，见图2B）。

2.3 观察各组大鼠SYP、GAP43 mRNA的表达与假手术+溶剂组（0.93±0.08）相比，脑梗死+溶剂组SYP 水平（0.44 ± 0.10）明显下降，而与脑梗死+溶剂组相比，脑梗死+尼可地尔组SYP 水平（0.63 ±0.13）升高（P<0.05，见3A、C）。与假手术+溶剂组（0.62 ± 0.05）相比，脑梗死+ 溶剂组GAP43 水平（0.84±0.07）增加。而与脑梗死+溶剂组相比，脑梗死+尼可地尔组GAP43 水平（1.04±0.10）进一步升高（P<0.05，见图3B、D）。

图2 各组大鼠水迷宫试验分析结果Fig.2 Results of morris water maze test of rats in each group

图3 各组大鼠SYP、GAP43 mRNA 分析结果Fig.3 Results of SYP and GAP43 mRNA of rats in each group

2.4 尼可地尔对各组大鼠SYP、GAP43 蛋白表达量的影响与假手术+溶剂组（1.04 ± 0.08）相比，脑梗死+溶剂组SYP 水平（0.67 ± 0.10）下降，而与脑梗死+溶剂组相比，脑梗死+尼可地尔组SYP 水平（0.97 ± 0.12）则有所升高（P< 0.05，见4A、C）。与假手术+溶剂组（0.59±0.07）相比，脑梗死+溶剂组GAP43 水平（0.79±0.10）增加。而与脑梗死+溶剂组相比，脑梗死+尼可地尔组GAP43 水平（0.99±0.12）进一步升高（P<0.05，见图4B、D）。

3 讨论

脑缺血后，轴突遭到破坏，机体产生代偿，与突触生长和重建有关的蛋白水平会发生变化，通过蛋白之间的相互作用，共同完成信息的传递作用，进而提高突触可塑性，促进神经功能的修复。其中，SYP 和GAP43 便是会随之变化的与突触传递有密切关系的蛋白［17］。因此，本研究把研究点着力于这两个因子的表达变化上。

图4 各组大鼠SYP、GAP43 蛋白分析结果Fig.4 Results of SYP and GAP43 protein of rats in each group

SYP 广泛存在于神经系统的神经末梢中，与其他突触蛋白互相作用，完成信息传递，具有调节神经递质释放的作用，影响突触可塑性［18］。研究表明，脑缺血会破坏突触，降低SYP 的表达［19-20］。与这些研究的结果一致，本研究中，脑梗死组大鼠SYP 水平较假手术组明显降低。而应用了尼可地尔的大鼠SYP 水平有所提高，提示尼可地尔可以抑制脑缺血后SYP 的减少。在成熟神经元中，轴突的生长处于一种抑制状态，GAP43 的水平很低。突触遭到破坏后，诱发大脑可塑性修复结构并进行功能性补偿，轴突被诱导生长和重建，许多与轴突生长有关的蛋白合成会增加，GAP43 则是其中之一［21］。有研究表明，脑缺血后，GAP43 水平会有不同程度的增长，第7 天达到高峰，第21 天则又明显降低，这可能和当建立代偿性突触连接时，GAP43 的表达会降低至基础水平有关系［22-23］。本研究选择了术后第7 天的时间点进行观察，结果显示，脑梗死组GAP43 水平较假手术组增加，尼可地尔则又进一步促进了GAP43 的增加。尼可地尔增加了SYP 和GAP43 的含量，说明其可能会促进脑梗死后突触的重建、再生，对脑梗死后的神经功能缺损有改善作用。

在mNSS 实验中，与脑梗死+溶剂组的比较，脑梗死+尼可地尔组神经功能缺损评分在术后第3、7、14 天有明显改善，说明在脑缺血后神经功能恢复过程中，尼可地尔促进了其进程，这可能与KATP 通道减轻钙离子超载，抑制细胞凋亡，扩张脑血管，增加脑血流量等作用有关［24］。同时，在尼氏染色的结果比较中，尼可地尔可以减少梗死体积，该结果具有统计学意义。本研究中，服用了尼可地尔的大鼠在水迷宫试验中发现隐藏平台的潜伏期更短，说明大鼠学习和记忆能力有所改善，进一步证实了尼可地尔对促进脑梗死后的功能恢复是有效的。曾有研究显示尼可地尔能激活海马KATP 通道并参与学习和记忆，这一发现与该研究结果一致。该有益作用可能与神经元损伤的减少，中枢胆碱能功能障碍的预防和氧化损伤的减少有关［8］。这表明尼可地尔可能改善了突触重塑，在MCAO 后的学习记忆功能恢复中起着重要的作用。

综上所述，本文通过对脑梗死模型大鼠实验的研究，发现尼可地尔可以改善脑梗死后功能缺损，这可能和提高了脑梗死后SYP 和GAP43 的表达，改善了突触可塑性有关。本研究为临床上运用尼可地尔治疗脑梗死提供一定的理论依据。本研究的不足在于没有进一步研究尼可地尔具体是通过何种信号通路来实现的保护作用，这有待在后续研究中进行探讨和验证。