余丽娟， 罗毅文， 熊云谱， 刘亚梅

（1.广州中医药大学，广东广州 510405；2.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东广州 510240；3.广州市正骨医院，广东广州 510045）

骨质疏松的老年群体发病率不断攀升，致骨折风险大大增加[1]。骨质疏松性骨折防治的重点在于促进骨重建，骨吸收和骨形成保持正平衡，维持骨量。而骨重建的过程是由成骨细胞、破骨细胞共同实施。成骨细胞功能与数量的异常可能是导致骨质疏松的一个原因[2]。成骨细胞是由骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化而来，可以分泌细胞外基质，促进骨形成。BMSCs 因其多向分化潜能、低免疫原性，已是骨组织修复工程中研究和应用最多的干细胞来源[3]。因此，寻找可以促进成骨分化的方法诱导BMSCs 向成骨方向分化，是骨质疏松症干预的一个重要研究方向。本研究采用补肾活血汤体外干预BMSCs，观察其对成骨细胞定向分化的调控作用，以期为该方应用于骨质疏松症等骨代谢性疾病提供分子生物学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验药物补肾活血汤组成:熟地黄18 g、补骨脂18 g、菟丝子18 g、杜仲6 g、肉苁蓉6 g、枸杞子6 g、山萸肉6 g、独活6 g、当归6 g、红花3 g、没药6 g。上述药材均购于广州中医药大学骨伤科医院中药房。将上述药材按剂量称取，传统方法煎煮后，浓缩至含生药量0.9 g/mL，冷却后置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.2含药血清的制备所有大鼠均由广州中医药大学实验动物中心提供。实验环境合格证号:44005900001722。动物质量合格证号:SCXK（粤）2013-0020。将20 只SD 大鼠随机分为4 组，即空白血清组，中药低、中、高剂量血清组，每组5 只。中药低、中、高剂量血清组给予补肾活血汤灌胃。其标准体质量60 kg 成人的临床每日常用剂量为1.65 g/kg，大鼠给药剂量据此按照人与动物表面积换算公式[4]所得，为4.42 g·kg-1·d-1（设为中剂量），高、低剂量分别为中剂量的2倍和1/2倍，即8.84、2.21 g·kg-1·d-1。空白血清组给予相同体积生理盐水灌胃。每天定时灌胃1 次，连续7 d。于末次给药1 h 后，腹腔麻醉，无菌条件下行心脏采血，分离血清上清，0.22 μm 滤膜过滤除菌后于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3主要试剂与仪器胎牛血清、DMEM 低糖培养基、2.5 g/L胰蛋白酶（美国Coring公司）；茜素红染色（ARS）剂、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；PE 标记的大鼠来源CD34、CD45、CD11、CD29、CD73 和CD44 单克隆抗体（美国Invitrogen 公司）；TRIzol 试剂、RNA 提取试剂盒、SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ（日本TaKaRa公司）；聚合酶链反应（PCR）引物合成（上海生工公司）。CKX31 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；SCW-HS-840 型超净工作台（苏州长春电子仪器厂）；流式细胞仪（美国BD公司）；B16UU CO2培养箱（德国Heraues 公司）；酶标仪（美国Thermo 公司）；PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 BMSCs的分离与分组处理取4 周龄SD 大鼠，颈椎脱臼法处死，无菌条件下分离出股骨和胫骨，置于DMEM 低糖培养基中反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，以1 000 r/min 离心5 min。弃上清液，加入含体积分数10%热灭活胎牛血清的DMEM 完全培养基，于37 ℃、体积分数5% CO2、完全饱和湿度条件下常规培养。每2 d 更换培养基，细胞生长铺满培养瓶底80%后，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，取P3 代细胞用于实验。分为中药高、中、低剂量组和空白血清组，分别加入10%（体积分数，下同）对应剂量补肾活血汤含药血清。

1.5 BMSCs表面抗原的鉴定取P3代细胞，2.5 g/L心5 min，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞制成单细胞悬液，1×106个细胞分装于离心管中。分别加入PE 标记的CD34、CD45、CD11、CD29、CD73 和CD44 抗体，室温避光孵育30 min，离心弃上清，加入400 μL PBS重悬为单细胞悬液，利用流式细胞术进行BMSCs鉴定。

1.6 4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNPP）偶氮法定量分析BMSCs的ALP活性以5×104个/mL 的单细胞悬液接种于96 孔板，每孔100 mL，细胞贴壁后按分组更换含药血清，每隔2 d 换液1 次，7 d 后去除细胞培养液。PBS 洗3 次，加入体积分数0.5%Triton 置冰上裂解，离心后取上清，避光加入PNPP（1 mg/mL），室温下孵育1 h，应用酶标仪于波长405 nm处检测光密度（OD）值。

1.7茜素红染色法观察钙盐沉积情况以5×104个/mL 的单细胞悬液接种入12 孔培养板，每孔1 mL，细胞贴壁后按分组更换含药血清，每隔2 d换液1 次。21 d 后去除细胞培养液，用PBS 冲洗细胞3 次，室温下40 g/L 多聚甲醛固定20 min，PBS 洗2 次。茜素红（0.5%）常温下染色30 min，蒸馏水冲洗2遍后干燥，封固，光镜下观察钙结节染色情况，呈红色的为钙结节。随机选取5个镜下视野拍照，使用ImageJ图像处理软件分析结果。

1.8实时荧光定量PCR法检测BMSCs中成骨分化相关基因Runx2、OCN、OPN mRNA表达以5×104个/mL 的单细胞悬液接种入12 孔板，细胞贴壁后按分组更换含药血清，每隔2 d 换液1 次，培养21 d。TRIzol法提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒（PrimeScript™RT Master Mix）将RNA 反转录为cDNA，用SYBR Green Premix Ex TaqⅡ进行检测，在Quant StudioTMReal-Time PCR 系统中根据试剂说明书设定反应参数（95 ℃5 min；循环:95 ℃15 s，60 ℃30 s，共35 个循环）。成骨分化相关指标引物序列如表1 所示。记录CT 值，根据2-ΔΔCT法计算各目的基因的相对表达量。

1.9统计方法采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，所有计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间比较，若满足正态和方差齐性，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差不齐，采用Dunnett’s T3 检验分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的形态观察与鉴定BMSCs 的生长方式为贴壁生长，镜下观察P3 代细胞，多呈梭形或纺锤形，胞浆丰富，集落生长，呈漩涡状，同向排列，形态一致。见图1。流式细胞仪检测结果显示，BMSCs 中CD44、CD29、CD73 高 表 达，而CD34、CD45、CD11 低表达，表明获得的细胞符合BMSCs的特点。见图2。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The RT-PCR primer sequences

图1 BMSCs的形态学表现（×100）Figure 1 Morphological features of BMSCs（×100）

图2 BMSCs细胞表面抗原表达Figure 2 Expression of surface antigens in BMSCs

2.2各组BMSCs的ALP活性比较补肾活血汤含药血清作用于BMSCs 7 d 后，ALP 活性检测结果显示，各中药剂量血清组ALP 活性较空白血清组明显升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01），且呈剂量依赖性。结果表明，补肾活血汤能够提高BMSCs 的ALP 活性，促进成骨分化。具体结果见图3。

2.3各组BMSCs钙结节情况比较钙盐变化是骨组织成骨潜能的标识之一。茜素红能与钙盐以鳌和方式形成复合物，故用以识别组织细胞的钙盐成分。通过茜红素染色生成的红色沉淀即为钙结节。诱导21 d 后，光镜下观察空白血清组散见红色沉淀物，量少，呈零星点状分布，而中药低、中、高剂量血清组均可见明显的红色沉淀物，较空白血清组明显增多，尤其是中药中、高剂量血清组，染色程度深，且呈片状分布，见图4。图5结果显示，各中药剂量血清组茜素红染色面积较空白血清组明显增加（P ＜0.05 或P ＜0.01），且呈剂量依赖性，结果表明，补肾活血汤可有效促进BMSCs的骨向分化、矿化。

图3 各组BMSCs的ALP活性比较Figure 3 Comparison of ALP activity in BMSCs of various groups

图5 各组BMSCs的茜素红染色面积比较Figure 5 Comparison of ARS area of BMSCs in various groups

图4 各组BMSCs钙结节分布比较（茜素红染色，×100）Figure 4 Comparison of distribution of calcium nodules in BMSCs of various groups（by ARS，×100）

2.4各组BMSCs中成骨分化相关基因Runx2、OCN、OPN表达比较图6 结果显示，与空白血清组比较，中药低、中、高剂量血清组BMSCs 中Runx2、OCN、OPN 基因表达水平升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），且呈剂量依赖性。

3 讨论

骨质疏松症是与年龄直接相关的疾病。“肾藏精，主骨，生髓”，骨的营养有赖于肾中精气的滋养，而肾中精气的盛衰与年龄相关，随着年龄的增长，肾中精气由盛转衰，天癸由充盛到衰竭，肾精不足以养骨，骨质退变疏松，伴随腰痛，行动、机体功能障碍，腰膝酸软无力等症状，中医学将这类证候归为“骨痿”。《内经》中提到“气血以流，腠理以密，如是则骨气以精”，骨质疏松局部精气不足，气血亏虚，血运渐缓，因此，血瘀是骨质疏松症常见的病理改变。故骨质疏松症呈现典型的虚实夹杂、本虚标实的特点。循证医学及临床报道表明，运用补肾活血法可以加速骨的修复，促进成骨，在防治骨质疏松症方面取得较好的疗效[5]。本课题组临床治疗骨质疏松症、骨折取得满意疗效的补肾活血汤[6-7]，是补肾活血法的代表方，出自《伤科大成》，方中:熟地黄、补骨脂、菟丝子、杜仲、肉苁蓉、枸杞子、山萸肉、独活补肾强腰膝，补益肾精以滋养骨髓，发挥成骨功能；当归、红花、没药活血以通络，瘀血去，新血得生，可为肾气补益及促进骨骼的生长和修复营造良好的环境。

图6 各组BMSCs 中成骨分化相关基因Runx2、OCN、OPN表达比较Figure 6 Comparison of the expression levels of osteogenesis-related gene Runx2，OCN and OPN in BMSCs

肾精源于先天，肾“主骨”“生髓”功能与干细胞的成骨特性不谋而合，BMSCs 在骨质疏松等相关骨病修复中起到的治疗作用已被证实[8-9]。骨质疏松症患者骨结构的损伤，与BMSCs 成骨分化作用减弱有关，植入的BMSCs 能够在不同的局部环境下分化为成骨细胞，在骨修复、骨形成阶段合成新的骨基质，促进细胞外基质的矿化，发挥成骨作用，完成骨修复[10]。对于骨质疏松和其他退行性骨病的问题，药物控制内源性间充质干细胞（MSCs）的数量和分化能力是一种潜在而有效的治疗方法[11]。中药复方成分复杂，无论何种方式给药，入血的成分方能发挥药理作用，血清药理学更接近药物在体内生物转化的过程，增加实验结果的可信性，故本研究选择补肾活血汤含药血清直接干预BMSCs，探讨其对BMSCs 在成骨分化过程中的作用。

ALP主要存在于骨组织中，是评价成骨能力的金指标之一。在成骨诱导7 d 左右，ALP 活性最高，21 d 左右，MSCs 基本分化完成，出现钙化结节。钙结节是细胞成骨分化的矿化指标，是分化成熟的最直观的标志物。本研究结果显示，补肾活血汤含药血清呈剂量依赖性地提高ALP 活性，茜素红钙结节染色也验证了补肾活血汤的骨向分化作用，尤其是中药中、高剂量组呈现出较高的骨向分化程度。

Runx2、OCN、OPN 是临床研究中评价成骨能力最常用的指标。Runx2是干细胞成骨分化的关键转录因子，在未分化的MSCs 中表达较少，在成骨细胞中大量表达，Runx2基因突变小鼠表现为骨骼缺失[12]。BMSCs 可通过激活Runx2 诱导不成熟骨细胞向成熟的成骨细胞分化，且抑制向脂肪细胞和软骨细胞分化，亦可经由Hedgehog和Wnt信号转导将骨祖细胞直接分化为成骨细胞，涉及Runx2、OSX、OPN、Smads 等转录因子。Runx2 可介导Hedgehog通路上调OSX、OPN 的表达，同时调节MSCs 向前体成骨细胞分化过程中所必须的非胶原蛋白（如OCN）[13-16]。OPN 由成骨细胞所分泌，主要介导细胞与基质间的细胞粘附，可促进骨吸收，骨基质矿化，是骨细胞进入矿化成熟阶段的标志，OCN高表达标志着成骨细胞的分化成熟[17-18]。本研究结果显示，中药低、中、高剂量血清组Runx2、OCN、OPN 基因表达量显著高于空白血清组，且随剂量增加而增高，表明补肾活血汤可以增加BMSCs 的矿化率，促进成骨。

综上所述，补肾活血汤可以发挥体外成骨作用，这可能是补肾活血汤临床抗骨质疏松症的机制之一。今后将进一步加强其机理研究，以期为临床应用补肾活血法治疗骨质疏松症提供理论依据。