陈聪,胡长利,谢晶,3*

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306) 2(上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海，201306) 3(食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海，201306) 4(南京卫岗乳业有限公司 研发中心，江苏 南京，211106)

牛乳是一种营养丰富的天然食品，含有人体所需的全部氨基酸、多种维生素和矿物质及乳糖、乳脂肪和乳蛋白等[1]，牛乳同时也是微生物的优良培养基，为延长牛乳的保质期、调节淡旺季，常会对其进行加工处理。浓缩是一种常用的牛乳加工步骤，可有效提高牛乳的总固形物含量，牛乳浓缩后也可以用于生产奶粉、炼乳等乳制品，以及降低冷冻牛奶冻结过程中的能耗。牛乳中水分含量约为87%，浓缩将牛乳中的部分水去除，将极大地降低加工、包装、贮藏和运输成本。

液态食品的浓缩方法主要有蒸发浓缩、冷冻浓缩和膜分离浓缩等。蒸发是食品工业中应用最广泛的浓缩方法之一，常在真空条件下进行，能有效降低浓缩温度。SABANCI等[2]研究了欧姆加热辅助真空蒸发对浓缩酸樱桃汁品质的影响，冷冻浓缩利用了冰和水溶液之间的固液相平衡原理，使部分水以冰的形式结晶析出并分离出去，从而实现浓缩。秦贯丰等[3]对比研究了苹果汁的真空蒸发浓缩和冷冻浓缩，结果表明冷冻浓缩的苹果汁品质更高，但真空蒸发浓缩能实现更高的浓缩浓度。膜分离浓缩利用分离膜的选择透过性将溶剂与溶质分离，达到浓缩的目的。牛乳是一种热敏性食品，过高的温度会破坏其营养物质，而膜技术是一种能在常温下实现分离的技术，因此在牛乳浓缩[4]，乳酪蛋白提取[5]，乳脂分离[6]等乳品工业方面应用广泛。经过浓缩后，牛乳中的酪蛋白胶束结构分布更加紧密，矿物质在可溶性相与胶体相之间的分布发生变化。有研究表明牛乳浓缩后总固形物含量上升，pH值降低，黏度增加[7]。

冻结作为一种保鲜方法，可抑制牛乳中微生物繁殖，降低脂肪酶和蛋白酶的活性，因而能够长期有效地保藏牛乳[8]。LUCCIA等[9]研究了在冷冻贮藏期间牛乳蛋白质的水解。RUTIGLIANO等[10]研究了牛乳在冷冻贮藏期间α-酪蛋白的含量变化。冻结食品品质会受到冻结方式的影响，有研究表明，冻结速率越快，冻品的品质越好[11]。谭明堂等[12]对比研究了冰箱冻结、平板冻结、螺旋冻结和超温冷库冻结4种冻结方式对鱿鱼品质的影响。目前关于牛乳的冻结研究，主要集中在冷冻贮藏期间牛乳的品质变化，而不同冻结方式对牛乳品质影响的研究鲜有报道。

为研发冷冻牛奶的新工艺，评估浓缩和冻结工艺对牛乳品质的影响，本实验以牛乳为研究对象，研究牛乳在浓缩后色度、粒度、热稳定性、乙醇稳定性等理化性质的变化，及不同冻结方式对其品质的影响，为牛乳的浓缩工艺的优化及冻结方式的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳(蛋白质3.13%，脂肪3.54%，总固形物11.83%)，上海奉贤某奶牛场；无水乙醇,生物工程(上海)股份有限公司；尼罗红、低熔点琼脂糖，美国Sigma公司；NaOH(分析纯)、丙酮(色谱纯)、酚酞，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

JW-Y-2540-08有机膜实验装置，江苏久吾高科技有限公司；Fluke 2640A 网络型多点温度采集仪，美国福禄克电子仪器仪表公司；螺旋式速冻机、平板速冻机，烟台冰轮股份有限公司；CR-400 型色彩色差计，日本柯尼卡美能达公司；MS2000激光粒度仪，马尔文仪器公司

1.3 实验方法

1.3.1 浓缩牛乳的制备

将牛乳用有机膜实验装置在进口压力为3.0 MPa，流量为1.5 m3/h的条件下进行膜分离浓缩，最终得到总固形物(total solids，TS)含量分别为14.94%，17.61%和23.01%(相当于2份牛乳变为1份)的浓缩乳样，TS测定采用在105 ℃烘箱中直接烘干法[13]。控制浓缩过程中温度不超过40 ℃。

1.3.2 冻结曲线的测定

将鲜牛乳和不同TS的浓缩牛乳分装于无菌袋，每袋2 L，分别采用-20 ℃冰箱、-30 ℃平板速冻机、-30 ℃螺旋速冻机及-30 ℃冷库进行冻结处理。将多点温度采集仪测温端用橡木块固定置于样品中心，记录牛乳中心温度的变化，待牛乳中心温度达到-18 ℃时取出样品，置于-20 ℃冰箱冻藏3 d；冻结牛乳在流水解冻后进行指标测定，以未经过冻结处理的鲜牛乳和浓缩牛乳为对照组。

1.3.3 色度测定

牛乳解冻后用色差计测定色差值L*、a*和b*，在测定牛乳色度前先进行白板校正，每个样品测3次。根据公式(1)计算总色差：

(1)

1.3.4 pH值的测定

将30 mL牛乳样品置于烧杯中，用经过校准的pH计测定其pH值。每个样品测定3次。

1.3.5 酸度的测定

参考GB 5009.239—2016[14]的方法进行测定。

1.3.6 粒度的测定

参考TRIBST等[15]的方法，采用MS2000型激光粒度分析仪测定牛乳样品的粒径分布。在粒度分析中D10、D50、D90分别表示粒径小于它的直径的颗粒占10%、50%、90%。分布宽度=(D90-D10)/D50，表示较大颗粒与较小颗粒直径差与平均直径的相对变化率。

1.3.7 乙醇稳定性的测定

参考张光地等[16]的方法，将使牛乳沉淀的最小乙醇溶液体积分数作为实验结果，记录数据。

1.3.8 热稳定性的测定

参考CROWLEY等[17]的方法，测定并记录牛乳样品自放入油浴锅至开始出现絮凝沉淀挂壁时所需要的时间，即牛乳的热凝固时间(heat coagulation time，HTC)，每个样品平行3次。

1.3.9 乳脂肪球显微结构的测定

参考迟雪露等[18]的方法进行测定。

1.3.10 SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳的测定

将牛乳在4 ℃、8 000 r/min条件下离心20 min，除去上层脂肪，用蒸馏水稀释到合适浓度，与蛋白质上样缓冲液按体积比4∶1混合均匀，沸水浴加热5 min，冷却至室温后进行上样。分离胶浓度为8%～20%，浓缩胶浓度为4%。电泳开始时，调节电压为120 V。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色2 h，脱色至背景清晰。

1.4 数据处理

实验数据为平行实验3次取平均值，曲线使用origin 2018软件绘制，数据使用SPSS 19.0进行分析。显著性分析中，“组内”表示总固形物含量相同时处理方式不同(小写字母表示)，“组间”表示处理方式相同时总固形物含量不同(大写字母表示)。

2 结果与分析

2.1 不同冻结方式下的牛奶冻结曲线

分装于无菌袋的牛乳在不同冻结方式下，其中心温度从4 ℃降至-18 ℃的变化曲线如图1所示。在不同的冻结方式下牛乳经过最大冰晶生成带(-1～-5 ℃)的时间有明显差异，通过最大冰晶生成带的时间越短，形成的冰晶越小，分布越均匀，越利于保存其品质。

由图1-a可知，鲜牛乳在冰箱冻结、冷库冻结、螺旋冻结和平板冻结时通过最大冰晶生成带的时间分别为368、149、85和27 min。冷库温度比冰箱温度低10 ℃，因此冷库冻结时间明显少于冰箱冻结。螺旋速冻机和平板速冻机内温度同为-30 ℃，螺旋速冻机内置风机使空气强制对流，提高了换热效率，比冷库冻结缩短了冻结时间。在平板速冻机中，装于无菌袋的牛乳平铺在平板上，样品与平板进行热传导来交换热量，因此平板冻结的时间最短，冻结速率最快。

在冻结方式相同的条件下，浓缩牛乳的冻结曲线走势与鲜牛乳的相类似，中心温度降至-18 ℃的冻结时间随着牛乳浓缩倍率的增加而下降。TS为23.01%的浓缩牛乳的冻结时间最短，由图1-d可知，其冰箱冻结、冷库冻结、螺旋冻结和平板冻结的时间分别为526、194、119和44 min。

a-TS 11.83%(鲜牛乳)；b-TS 14.94%；c-TS 17.61%；d-TS 23.01%图1 乳样在不同冻结方式下的冻结曲线Fig.1 Freezing curves of milk with different TS under different freezing methods

2.2 色度

不同浓缩程度与冻结方式下牛乳的色度变化见表1。其中L*、a*和b*分别表示黑白度、红绿度和黄蓝度。牛乳浓缩后随着TS的升高，L*值显著增加(P<0.05)，其原因可能是牛乳浓缩后随着TS的升高，蛋白含量增加，有研究表明牛乳蛋白质含量越高牛乳越白[19]。冻结后乳样的L*有下降趋势，可能是由于乳样冻结过程中酪蛋白胶束结构的变化引起。TS相同时，不同冻结方式对乳样L*值的影响较小。对照组中乳样的-a*值随着TS的升高呈增大趋势，经过冻结后-a*值显著降低(P<0.05)，且-a*值随着不同冻结方式冻结速率的增加出现上升趋势，这可能是由于蛋白质聚集而引起。牛乳浓缩后b*值显著增加(P<0.05)，其原因可能是随着TS的升高，牛乳脂肪含量增加，有研究表明牛乳的黄度与乳脂肪含量密切相关[18]。经过冻结后牛乳的b*值显著增加，且随着不同冻结方式冻结速率的提高，b*值呈下降趋势，这是因为牛乳在冻结过程中乳脂球遭到破坏，且冻结速率越慢破坏程度越高，在解冻后易发生聚集，因而造成乳样的b*值增大。牛乳经浓缩后ΔE*显著增大(P<0.05)，TS相同时，冰箱冻结的ΔE*显著高于另外3种冻结方式，由于冰箱冻结时间长，通常对牛乳整体色度的影响也较大。TS为23.01%时，不同冻结方式对乳样的ΔE*影响较小，可能是由牛乳的浓缩倍率过高引起。牛乳中通常含有核黄素等天然色素，也会在一定程度上影响牛乳的色度。

表1 浓缩与冻结方式对牛乳色度的影响Table 1 Effect of concentrating and freezing methods on color of milk

2.3 pH和酸度

由图2可知，冻结前TS为11.83%的乳样pH值为6.75，经过浓缩处理后pH值显著降低。pH值反映了乳中处于电离状态的活性氢离子的浓度[20]，在牛乳TS升高时，乳样中离子平衡发生变化，使电离状态的活性氢离子浓度增大，乳样pH值降低。牛乳在冻结后pH值出现下降趋势，可能是由于在冻结过程中水分结晶析出，离子强度增加，使得钙离子与酪蛋白胶体结合的平衡向磷酸钙沉淀转移[21]。有研究表明巴氏杀菌水牛奶在冷冻前后及冷冻贮藏期内pH值呈下降趋势[22]。TS相同的乳样经不同方式冻结后，其pH值无显著变化(P>0.05)。

图2 浓缩与冻结方式对牛乳pH值的影响Fig.2 Effect of concentrating and freezing methods on pH of milk 注：不同小写母表示组内差异显著(P<0.05)， 不同大写字母组间差异显著(P<0.05)(下同)

酸度是衡量牛乳新鲜程度的重要指标，主要受到牛乳中酪蛋白、磷酸盐、柠檬酸盐以及碳酸盐等物质的影响[23]。浓缩与冻结方式对牛乳酸度的影响见图3。

图3 浓缩与冻结方式对牛乳酸度的影响Fig.3 Effect of concentrating and freezing methods on titratable acid of milk

由图3可知，随着TS的增加，乳样的酸度显著增大(P<0.05)，这是由于随着牛乳浓缩倍率的提高，乳样中酪蛋白、磷酸盐、柠檬酸盐以及碳酸盐等酸性物质浓度增加。乳样在浓缩处理时，随着浓缩倍率提高，浓缩所需要的时间增加，这也会导致乳样中的乳糖在乳酸菌的作用下降解产生有机酸[7]，导致乳样的pH值下降，酸度增加。在TS相同时，冻结方式对乳样的酸度无显著影响(P>0.05)。

2.4 粒度

牛乳的粒度分布呈双峰特征，由乳中蛋白质与乳脂肪球粒径不同引起。由表2可知，鲜牛乳中90%的颗粒粒径小于0.767 μm，50%的颗粒粒径小于0.188 μm，在牛乳经过浓缩处理后，比表面积显著减小，而随浓缩程度进一步提高,比表面积减小趋势变缓，表面积平均粒径和体积平均粒径均显著增大(P<0.05)，粒径的分布宽度有增大趋势。乳样经过不同方式冻结后，比表面积出现减小趋势，体积平均粒径显著增大(P<0.05)，其中在TS为23.01%时，冰箱冻结的乳样其表面积平均粒径(0.168 μm)和体积平均粒径(0.906 μm)显著高于另外3种冻结方式。同时，在乳样经过冻结后，粒径分布宽度出现随牛乳的浓缩程度提高而增大的趋势，即TS越高冻结对其粒径分布的影响越大。浓缩与不同冻结方式对乳样的D10值影响不显著(P>0.05)。牛乳在浓缩之后，乳样中的酪蛋白胶束间距变小，促进了酪蛋白胶束结构相互聚集[24]，同时密集分布的乳脂肪球也更容易凝聚[25]，这导致了牛乳在浓缩后平均粒径的增加。在冻结过程中，乳样中的水结晶析出，造成酪蛋白胶束及乳脂肪球的分布更加密集，促使酪蛋白胶束和乳脂肪球进一步的聚集和凝聚，因此冻结后乳样的平均粒径增加，由于冰箱冻结速率慢，酪蛋白胶束和乳脂肪球聚集和凝聚增加更加显著。

2.5 乙醇稳定性

牛乳中乳酪蛋白胶粒具有亲水性，在周围形成结合水层，以稳定的胶体结构分散在牛乳中。结合水层在遇到酒精时易被脱去，使酪蛋白凝聚沉淀。因此牛乳的乙醇稳定性能一定程度反映牛乳蛋白质的稳定性。图4为牛乳经过浓缩与冻结后，其乙醇稳定性的变化。由图4可知，未经过浓缩与冻结的乳样具有最高的乙醇稳定性(85%)，所有TS为11.83%的乳样，出现沉淀的最小乙醇体积分数均不低于75%，说明牛乳在冻结之后仍有较好的乙醇稳定性。随着TS的

表2 浓缩与冻结方式对牛乳粒度的影响Table 2 Effects of concentrating and freezing methods on milk particle size

升高,乳样出现沉淀的最小乙醇体积分数显著减小(P<0.05)，且降低的幅度出现变大趋势。在TS相同时，乳样的乙醇稳定性在冻结后显著降低(P<0.05)，且乙醇稳定性与冻结速率表现出正相关，其中冰箱冻结乳样的乙醇稳定性最低。TS在11.83%～17.60%时平板冻结的乳样乙醇稳定性和对照组一致，说明平板冻结对牛乳的乙醇稳定影响最小。

图4 浓缩与冻结方式对牛乳乙醇稳定性的影响Fig.4 Effects of concentrating and freezing methods on ethanol stability of milk

2.6 热稳定性

浓缩与冻结方式对牛乳热稳定性的影响如图5所示。由图5可知，对照组中，TS为11.83%乳样的热稳定性最好,HTC为18.4 min，随着TS升高,HTC显著下降(P<0.05)，分别下降了19.0%(TS 14.94%)，49.4%(TS 17.61%)和82.6%(TS 23.01%)。乳样冻结后热稳定性显著下降(P<0.05)，冰箱冻结的乳样的热稳定性最差，冷库冻结、螺旋冻结和平板冻结的乳样热稳定性无显著差异(P>0.05)。在牛乳浓缩过程，乳清中的钙离子向酪蛋白胶束结构中转移[26]，改变胶束结构电荷数，引起胶束间静电相互作用改变，冻结也会造成游离钙离子向酪蛋白胶束中转移[25]，使浓缩、冻结后乳样的热稳定性降低。

图5 浓缩与冻结方式对牛乳热稳定性的影响Fig.5 Effects of concentrating and freezing methods on heat stability of milk

2.7 乳脂肪球的显微结构

乳中脂肪以微小球状或液滴状分散在乳液体系中[27]。由图6可知，在相同的冻结条件下，乳样浓缩后随着TS的升高，乳脂肪球的数量和直径均显著增加(P<0.05)。在TS相同的条件下，同对照组相比，冻结后乳样中乳脂肪球直径显著增大(P<0.05)，且随着冻结速率的降低,乳脂肪球直径变大。牛乳在浓缩过程中随着TS的升高，脂肪含量也按比例增加，这将会导致乳脂肪球分布更加密集。有研究表明乳脂肪球粒径与脂肪含量成正相关关系[28]，这也解释了牛乳平均粒径在浓缩处理后会变大。在牛乳冻结过程中冰晶的形成，乳脂肪球分布变密，同时乳脂球膜因为渗透压变大遭到破坏，使得乳脂肪球相互凝聚[29]。由此得出，冻结速率是乳脂肪球直径变化最重要的原因，同时也证实了牛乳在冻结后平均粒径会增大。

2.8 SDS-PAGE

乳蛋白是牛乳中最重要的成分，是人类膳食蛋白质的来源之一[30]。乳蛋白主要包括α-酪蛋白(α-casein, α-CN)，β-酪蛋白(β-casein, β-CN)，κ-酪蛋白(κ-casein, κ-CN)，β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-LG)，α-乳白蛋白(α-lactalbumin, α-LA)，乳铁蛋白(lactoferrin, LF)，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)[31-32]。由图7可知，在相同的冻结条件下，随着TS的升高，乳样中蛋白条带强度显著增加(P<0.05)，蛋白电泳条带的强度可反映出蛋白质含量的高低，因此经过浓缩后乳样中的蛋白质含量显著增加(P<0.05)，说明了在浓缩过程中有机膜浓缩装置可有效地实现牛乳蛋白质的截留。TS相同时，乳样在冻结后分子量在66.2～97.4 kDa的条带强度显著增加(P<0.05)，其原因可能是冻结造成蛋白质聚集。在不同方式冻结中，相同TS乳样的β-LG条带强度有减弱趋势，这可能是由于冻结使β-LG与酪蛋白胶束结合，这也解释了牛乳在冻结对平均粒径变大的现象。

CK-对照组；A-冰箱冻结；B-冷库冻结；C-螺旋冻结；D-平板冻结； 1-TS 11.83%；2-TS 14.94%；3-TS 17.61%；4-TS 23.01%图6 浓缩与冻结对乳脂肪球显微结构的影响Fig.6 Effects of concentrating and freezing on the microstructure of milk fat globules有研究表明[33]，牛乳在旋转蒸发浓缩过程中会形成分子量超过100 kDa且随浓缩程度增加而增加的蛋白质聚集体，而在本次实验中未发现明显的蛋白质聚集体，一方面可能是蒸发浓缩的温度更高所致，另一方面可能是由于旋转蒸发仪在旋转过程中产生的剪切力引起乳蛋白疏水性的变化，从而引起聚集。

CK-对照组；A-冰箱冻结；B-冷库冻结；C-螺旋冻结；D-平板冻结；1-TS 11.83%；2-TS 14.94%；3-TS 17.61；4-TS 23.01%图7 浓缩与冻结对牛乳蛋白SDS-PAGE的影响Fig.7 Effects of concentrating and freezing on milk protein SDS-PAGE

3 结论

通过测定牛乳色度、pH值、酸度、粒度等理化指标，结合乳脂肪球微观结构及乳蛋白SDS-PAGE电泳，对比分析了浓缩程度和不同冻结方式对冷冻牛乳品质的影响。研究表明，经过浓缩后，随着总固形物含量的升高，牛乳总色差值、酸度、平均粒径显著增加(P<0.05)，pH值、乙醇稳定性、热稳定性显著降低(P<0.05)。冰箱冻结、冷库冻结、螺旋冻结和平板冻结均会对牛乳的理化性质造成不同程度的影响，冻结后牛乳粒度分布宽度、乳脂肪球粒径显著增大(P<0.05)，乙醇稳定性、热稳定性、β-乳球蛋白含量显著降低(P<0.05)。不同冻结方式对牛乳pH值、酸度的影响不显著(P>0.05)，但对乳脂肪球直径的影响明显，随冻结速率的降低乳脂肪球直径增加。冰箱冻结牛乳的平均粒径及乳脂肪球粒径均为最大，平板冻结的牛乳在色差、乙醇稳定性和热稳定性上最接近鲜牛乳。综合上述结果，推荐将牛乳浓缩至总固形物含量为23.01%，采用平板冻结对牛乳进行冻结。