闫宗斌， 薛书江， 宋建臣， 许应天

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

猪附红细胞体(Mycoplasmasuis)，主要附着在猪的红细胞表面、血浆及骨髓，引起猪的黄疸性贫血、急性或慢性传染性贫血[1-3]。患病猪临床特征表现为发热、贫血、黄疸等症状，严重时可导致猪的死亡[4]。而且，该病常与其他的疾病混合感染，增加了该病的诊断难度[5-7]，当前在全球范围内均流行过该病，给养殖业带来了一定的经济损失。

目前，猪附红细胞体病诊断的方法主要有血液压片镜检、血液涂片染色镜检、ELISA等血清学方法、PCR法、荧光定量PCR法和PCR-ELISA法[7-8]，这些方法的检测时间、敏感性与特异性等方面都各有一定的局限性。目前，PCR技术诊断方法相对于其他方法更为快捷，且准确性高，是最具有一定优势的诊断方法。为寻求最佳的猪附红细胞体诊断方法，该试验进行了猪附红细胞体eno基因的PCR诊断方法的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1) 血样来源 采自延边某猪场附红细胞体病典型临床症状的可疑病例的抗凝血40份。

2) 对照样品DNA 猪肺炎支原体DNA、多杀性巴氏杆菌DNA、弓形虫DNA、猪链球菌DNA和猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA样本均由延边大学预防兽医学实验室保存。

3) 主要试剂 DNA血液提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，质粒小量提取试剂盒均购自Omega生物工程公司，100 bp DNA Ladder、ExTaq、DL2 000 Marker、DL5 000 Marker、pMD19-T Simple Vector、pfu DNA聚合酶均购自宝生物(大连)生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据GenBank上发表的猪附红细胞体基因序列(AB265823.1)，设计1对特异引物(P1：5’-AGGTAACCCAACCGTAGCAT-3’，P2：5’-TCTTAACTCCCTTTCCTCCAA-3’)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增与退火温度的……