薛晓敏，韩雪平，陈 汝，王来平，王金政

（山东省果树研究所，山东 泰安 271000）

化肥一直以来作为农业增产的重要手段，我国化肥消费量达5.56×1010kg，占世界化肥总消费量的34%［1］，我国大部分耕地土壤贫瘠［2］，加上长期施用化肥、除草剂和杀虫剂及无节制的掠夺式生产模式，破坏了土壤结构，造成土壤营养元素严重缺失，土壤酸化，土地生产能力显著下降［3-4］，基于目前化肥不当使用带来的危害以及国家对于减少化肥使用的政策驱动，生物有机肥以具有改良土壤肥力、促进作物营养吸收、提高农作物产量及改善品质等独特的优势成为化肥的替代品，对农业的发展具有重大意义［5-7］。

海藻肥是以天然海藻为原料，通过物理和生化工艺提取、精制或再混配以氮磷钾和微量元素制成的生物肥，含有海藻特有的海藻酸钠、矿物质、氨基酸和植物自然生长调节物质等［8］。很多研究表明，施用海藻肥后可促进植物根系发育和主茎的伸长，提高农作物产量，改善果实品质，增强对干旱环境的抵抗力［9-10］，还具有抗病抑菌作用和防止病虫害的发生［11］。葡萄籽肥是以天然葡萄籽制成的肥料，含有多酚化合物、氨基酸、矿物质、脂肪等有益于植物生长的物质［12-14］，多用于医学，可以温和抑制口腔病原菌微生物，是一种非常有前景的天然抗菌物质［15］。目前，对于生物有机肥的研究主要集中在不同类型功能微生物的筛选、生产工艺和技术以及对农作物产量的影响［16］，而关于生物有机肥对土壤微生物的研究却少见报道。微生物是土壤中重要的组成部分，它们在改善土壤质量、提高土地生产力和土壤健康可持续发展方面发挥着重要作用［17］，不同的施肥处理很大程度上影响土壤微生物的群落结构与数量［18-19］。因此，对施加生物有机肥后土壤微生物群落结构变化的研究具有重要意义。本研究以7年生烟富3苹果为试材，对施加45%有机肥、葡萄籽肥和海藻肥以后树体生物量、产量及果实品质进行了测定，同时，采用高通量测序技术，对土壤微生物群落结构进行研究，为今后生物有机肥在果园生产上的有效应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验园概况

试验在文登市泽头镇峰山村果园进行，该园地处东经121°43′～122°19′，北纬36°52′～ 37°23′，年均降水量762.2 mm，降水分布不均，夏季集中，6～9月份降水量约占全年70 %，春秋季降水偏少，常发生干旱；年平均气温11.5℃，极端最高气温36.4℃，极端最低气温-25.5℃，年日照时数2 540.7 h，无霜期194 d。试验地土壤类型为棕壤土，建园前为杨树林，土壤肥力水平较差。

1.2 试验材料

供试品种为7年生‘烟富3’，砧木为平邑甜茶（Malus hupenensisRehd.），2010年春季定植建园，株行距3.0 m×5.0 m，南北行向，树形为小冠疏层形，行间自然生草，树盘起垄栽培，有滴灌系统，管理水平偏上。

1.3 试验设计

试验设3个有机肥处理（表1），分别为海藻有机肥11 250 kg/hm2、葡萄籽有机肥4 500 kg/hm2、45%有机肥11 250 kg/hm2（对照CK），其中，海藻有机肥有机质含量≥45%，N+P+K≥5%；葡萄籽有机肥有机质含量≥90%，N+P2O5+K2O≥12%；45%有机肥有机质含量≥45%，有效活菌数≥0.2亿/g，N+P+K≥5%。选择树势均匀一致的苹果树为样本树，10株树为一小区，3次重复，每处理共计30株树。2016年10月，在样本树四周距树干30 cm左右挖深度约30 cm的放射沟，将有机肥进行沟施，然后覆土、浇水。生长季除6月份每株树追施500 g左右果树专用复合肥（N≥16%，P2O5≥6%，K2O≥32%）外，不再施其他肥料，其它管理按常规进行。

表1 试验处理

1.4 样品采集

1.4.1 土壤样品采集

于果实成熟期进行土壤样品采集。采用五点取样法，分别在处理的30株样本树东、南、西、北4个方位距树干60 cm处用直径4 cm土壤取样器采集 0～20、20～40 cm土壤，去除杂质后进行混合，装进封口袋放进干冰中带回实验室，-80℃冰箱保存用于微生物多样性分析。

1.4.2 果实采集

果实成熟后在样本树树冠外围1.3～1.5 m高度随机采果50个，运回实验室测定单果重、纵横径、着色指数、光洁度指数、果肉硬度、可溶性固形物含量等品质指标。

1.5 测定项目及方法

1.5.1 高通量测序方法

采用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒对样本的基因组DNA进行提取，之后取3 μL进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度和浓度。之后使用ABI9700 智能梯度PCR仪进行PCR扩增，第一次PCR扩增体系包括：10 μL 5xBuffe，1 μL dNTP（10 mmol/L），1U Phusion 超保真DNA聚合酶，F/R内侧引物（10 μmol/L）各1 μL，20 ng模板，ddH2O补至 50 μL；第二次PCR扩增体系包括8 μL 5xBuffe，1 μL dNTP（10mM），0.8 U Phusion 超保真DNA聚合酶，1 μL F/R 外侧引物（10 μmol/L），5 μL模板，ddH2O补至 40 μL。引物对应区域：16S V4-V5 区引物（515F和926R），鉴定细菌多样性；ITS1区引物（ITS1F和ITS1R），鉴定真菌多样性。

采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，采用FTC-3000TMreal- time PCR仪对凝胶回收产物进行定量，使用Tru Seq® DNAPCR-Free Sample Preparation Kit 建 库 试剂盒进行文库构建，构建好的文库用 FTC-3000TM real-time PCR 仪进行实时荧光定量，文库合格后，使用Hi Seq2500 PE250进行上机测序。

1.5.2 树体结构及枝类组成的调查测定

于落叶后用卷尺及游标卡尺测量树高、干径、冠径、外围新梢长度，并统计叶丛枝、短枝、中枝、长枝、徒长枝数量，计算枝类比例。

1.5.3 产量调查

果实成熟后单株数果，单位枝采果、称重，计算平均单果重和折合每公顷产量。

1.5.4 果实品质的测定

单果重用 1/100 电子天平称量，果实纵、横径用数显游标卡尺测量，果实去皮硬度用GY-1 型果实硬度计测量，可溶性固形物含量用数显糖量计测定，果面色泽用日本产CI-410色差计 测定。

果面着色指数=∑（各级果数×代表级值）/（总果数×最高级值）×100%

光洁度指数=∑（各级果数×代表级值）/（总果数×最高级值）×100%

分级标准如表2所示。

表2 果实着色和光洁度分级标准 （%）

1.6 数据分析

测序数据采用双端fastq 格式保存（fq1和fq2），并根据 Barcode 信息对原始序列进行拆分，确定各样本对应的有效序列数。用Trimmomatic软件对有效序列进行质量过滤，用FLASH软件对每个样品的reads进行拼接［20］；再使用Mothur 1.33.3软件去除（screen），得到优化序列（clean Tags）［21］。利用Uparse在97%相似度下进行优化序列聚类，得到OTU的代表序列，再用Uchime去除嵌合体［22］，其中16S嵌合体数据库为gold database（v20110519），ITS嵌合体数据库为UNITE（v20140703）；然后用usearch_global筛选OTV的代表序列，通过Mothur（classify.seqs）软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值为0.8。

使用Mothur软件分析Alpha多样性［23］，包括Chao1、Ace及Simpson指数；使用R软件绘制稀释曲线、聚类图等，使用Excel 2010和SPSS 23.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 施用不同肥料对红富士树体生长的影响

由表3可以看出，与45%有机肥处理（CK）相比，经过葡萄籽肥G和海藻肥F处理后红富士的株高和地径均有所提高，差异表现不显著；冠径在东西方向表现为F>G>CK，差异显著，而南北方向则相反，其中 CK与F之间差异显著；外围新梢表现为葡萄籽肥G显著高于海藻肥F和CK；枝类比例中海藻肥处理叶丛和短枝比例最高，占总枝量的59.53%，而长枝和徒长枝比例最低，为33.23%，其次是葡萄籽肥，分别为54.42%和37.22%，而CK比例最低，分别为53.80%和37.62%。

表3 生物有机肥对红富士树体生长发育的影响

2.2 施用不同肥料对红富士产量的影响

由表4可以看出，与有机肥处理（CK）相比，经过葡萄籽肥G处理后红富士的平均单株果数、平均单果质量、单株产量和每公顷产量均显著增加，分别增加了13.55%、4.31%、18.44%和18.44%；经过海藻肥F处理后红富士的平均单果质量、单株产量和每公顷产量均显著增加，分别增加了5.18%、1.11%和1.11%；

表4 生物有机肥对红富士产量的影响

2.3 施用不同肥料对红富士果实品质的影响

果实品质测定结果（表5）显示，红富士着色指数和光洁度指数均表现为海藻肥F>葡萄籽肥G>有机肥（CK），表现出显著性差异；果形指数以及可溶性固形物含量在处理间均无明显差异；色泽 L、a和b均表现为海藻肥F最大，其中色泽L葡萄籽肥G与CK差异不显著；阳面硬度均高于阴面硬度，但在处理间差异均不显著，综合而言，生物有机肥处理对果实外观及内在品质优于CK，其中，海藻肥处理果实品质最好，果实着色面积最大（着色指数88.89%），颜色最红（a 值39.33），果面光洁度最高（光洁度指数85.48%、L值49.80），果肉阳面硬度最高（9.18 kg/cm2），可溶性固形物含量较高。

表5 生物有机肥对红富士果实品质的影响

2.4 样品测序结果评估

通过数据统计软件处理各阶段样品序列数，评估数据质量。各样品测序数据评估结果如表6 所示。

稀释性曲线可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度［24］，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，由图1可以看出，在一定范围内，随着测序数的增多，若曲线表现为急剧上升，则表示群落中有大量物种被发现；当曲线趋于平缓时，则表示此环境中的物种并不会随着测序数量的增加而明显增多［25］。样品稀释曲线分别在测序数为 20 000 条处逐渐趋向平坦，而表6显示，细菌的优化测序数量超过25 000条，真菌的优化序列超过40 000条，说明样品序列充分，测序数量合理。

表6 土壤样本细菌和真菌测序结果统计

图1 土壤样本细菌和真菌稀释曲线

2.5 施用不同肥料对土壤微生物群落组成的影响

从图2可以看出，不同生物有机肥处理细菌和真菌门水平相对丰度和群落组成发生一定改变，土壤中的优势细菌群落包括酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi），非优势细菌包括衣原体门（Gracilibacteria、Chlamydiae）、梭杆菌门（Omitrophica、Fusobacteria）等（图2左），同时0～20和20～40 cm土层优势群落的相对丰度会发生调整。与有机肥处理（CK）相比，海藻肥F处理后0～20和20～40 cm土层酸杆菌门的相对丰度均有所提高，较对照分别提高了13.18%和191.42%；降低了变形菌门和拟杆菌门的相对丰度，较对照分别降低了14.39%、13.27%和64.39%、29.67%；降低了0～20 cm土层芽单胞菌门的相对丰度，提高了20～40 cm土层芽单胞菌门的相对丰度。葡萄籽肥处理后0～20和20～40 cm土层酸杆菌门的相对丰度均有所降低，较对照分别降低了43.52%和16.67%；提高了0～20 cm土层变形菌门的相对丰度，降低了20～40 cm土层变形菌门的相对丰度；降低了0～20 cm土层芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度，较对照分别降低了18.15%和10.49%，提高了20～40 cm土层芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度。值得注意的是，海藻肥处理后20～40 cm的第一大优势门是酸杆菌门，其他处理的第一大优势菌门是变形菌门。子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）是土壤中含量最丰富的两大真菌群落（图2右），对0～20 cm土层来说，海藻肥和葡萄籽肥处理均提高了子囊菌门的相对丰度，其相对丰度表现为G_1>F_1>E_1，降低了接合菌门的相对丰度，其相对丰度表现为E_1>F_1>G_1；对20～40 cm土层来说，海藻肥和葡萄籽肥处理均提高了接合菌门的相对丰度，其相对丰度表现G_1>F_1>E_1，其中海藻肥处理提高了子囊菌门的相对丰度，较对照提高了56.88%，葡萄籽肥处理降低了子囊菌门的相对丰度，较对照降低了47.04%。不同生物有机肥处理均不同程度上改变了不同土层细菌和真菌的群落组成。

图2 门分类水平土壤样本细菌和真菌群落组成

2.6 施用不同肥料对土壤微生物Alpha多样性的 影响

Alpha多 样 性（Alpha diversity）包 括Chao1指数、Ace指数、Shannon指数以及Simpson指数等。前面3个指数越大，最后1个指数越小，说明样品中的物种越丰富［26-27］。由表7可以看出，对于0～20 cm土层，海藻肥和葡萄籽肥处理后土壤细菌Ace指数和Chao1指数变化较小；海藻肥处理后降低了土壤细菌Simpson优势度指数，提高了土壤细菌Shannon 指数，葡萄籽肥处理正好与此相反，3种生物有机肥处理土壤细菌Simpson优势度指数以G最高，达到0.055 3。海藻肥和葡萄籽肥处理均提高了土壤真菌Ace、Chao1丰富度指数和Simpson优势度指数，显著降低Shannon指数。对于20～40 cm土层，海藻肥处理后降低了土壤细菌和真菌Ace、Chao1丰富度指数和Shannon指数，显著提高Simpson优势度指数；葡萄籽肥处理则提高了土壤细菌和真菌Ace、Chao1丰富度指数和Shannon指数，显著降低了Simpson 优势度指数。由此可见，不同生物有机肥处理后在不同程度上改变了土壤细菌和真菌的群落多样性，海藻肥和葡萄籽肥处理后表层土壤细菌多样性增加，真菌多样性降低。

表7 树盘覆盖对土壤微生物Alpha多样性的影响

2.7 土壤物种丰度聚类热图

Heatmap 是以颜色梯度来代表数据矩阵中数值的大小并根据物种或样品丰度相似性进行聚类的1种图形展示方式。将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样品群落组成的相似性和差异性。纵向聚类表示不同物种在各样品间丰度的相似情况，2 个物种间距离越近，枝长越短，说明这2个物种在各样品间的丰度越相似；横向聚类表示不同样品的各物种丰度的相似情况，与纵向聚类一样［16］。对土壤中相对丰度前50的细菌和真菌属进行聚类分析（图3）得知，葡萄籽肥处理后0～20和20～40 cm土层细菌和真菌群落均聚为1个分支，表明其组内差异较小，E_1、F_1、G_1、G_2和 E_2样品最终聚为一大类，最后与F_2的样品聚为一类，表明E_1、F_1、G_1、G_2和 E_2的组间差异相对较小，而与F_2在属水平的物种组成上有一定差异。在属水平上的真菌多样性丰度图（图4左）显示，海藻肥和葡萄籽肥处理后0～20和20～40 cm土层真菌优势属的丰度与有机肥处理（CK）差异较小，Geratobasidlum优势属的丰度在土壤真菌群落中显著降低，其中F_2处理Clonostachys（螺旋聚孢霉属）、Lecanicillium（蚧霉属）、Exophiala（外瓶霉属）、Mrakia（木拉克酵母属）、Gliomastix（粘鞭霉属）、Coprinus（鬼伞属）等14个优势属在土壤真菌群落中显著降低；在属水平上的细菌多样性丰度图（图4右）显示，葡萄籽肥处理后G_1（0～20 cm）和G_2（20～40 cm）优势属的丰度差异较小，海藻肥处理后F_1（0～20 cm）和F_2（20～40 cm）优势属的丰度差异显著，F_1（0～20 cm）和CK的E_2（20～40 cm）优势属的丰度差异 较小。

图3 不同生物有机肥处理在属水平上的细菌和真菌群落结构聚类图

图4 属水平土壤样品细菌和真菌丰度聚类热图

3 讨论

3.1 生物有机肥对红富士树体生物量的分析

中国虽是世界第一大苹果生产国，但并不是苹果生产强国［28］。由于过度追求苹果大小和产量，长期化肥单施和过量施用导致土壤板结、酸化、盐渍化，果树根系生长环境恶化，使得苹果产量和品质下降［29］。宋以玲等［30］研究发现用不同比例和种类的生物有机肥代替化学氮肥的投入在一定程度上可以提高作物产量及品质，这与本试验研究结果一致，3种有机肥处理均在不同程度上提高了红富士树体的生长。有研究发现，生物有机肥是采用完全腐熟的加工工艺，虫卵死亡率能够达到95%以上［31］，还具有使用方便，营养元素丰富，改善土壤条件，提升作物生产质量，改善作物根系微生物群等特点［32-34］，为树体的生长提供了良好的土壤环境，从而促进了果树的株高和地径，张奇等［35］研究发现生物有机肥在施用量为6 750 kg/hm2时土壤养分含量和生物功能改善效果明显，作物产量在短期内可以显著得到提升，本试验研究也发现海藻有机肥在施用量为11 250 kg/hm2、葡萄籽有机肥在施用量为4 500 kg/hm2时可以明显提高红富士果树的产量，且果实品质优良，这可能与生物有机肥处理可以改善土壤性质，提高土壤养分含量有 关［36］，这与姜洁等［37］研究结果一致。

3.2 生物有机肥对红富士土壤微生物群落的分析

微生物群落在土壤有机质分解和营养元素循环中有着至关重要的作用，因此，土壤微生物群落的数量、结构和活性与生态系统功能密切相关，只有健康、良性循环的土壤生态环境才能保证植物的健康生长［38］，曲成闯等［39］、袁英英等［40］研究表明，施用生物有机肥可以提高黄瓜和西红柿土壤的酶活性，调控土壤微生物群落结构，增强土壤微生物生态系统的稳定性。随着分子生态学研究技术的发展，高通量测序技术成为了研究土壤微生物多样性和群落结构特征的重要途径［41］，本研究利用高通量测序技术对施加生物有机肥后不同土层的土壤进行研究发现，施加生物有机肥之后增加了0～20 cm土层细菌的多样性和丰富度，减少了真菌的丰富度和多样性，对于20～40 cm土层，海藻肥处理后减少了土壤细菌和真菌的丰富度和多样性；葡萄籽肥处理则提高了土壤细菌和真菌的丰富度和多样性，这刘振香等［42］的研究结果一致；贺文员等［43］研究发现施加生物有机肥（QD）之后变形菌门（Proteobacteria）、子囊菌门（Ascomycota）分别是细菌和真菌中的优势物种，α-多样性分析显示QD使用前后真菌的多样性显著减少，这与本试验研究结果一致，施用海藻肥处理后不同土层子囊菌门的相对丰度上升，施用葡萄籽肥处理后0～20 cm 土层子囊菌门的相对丰度上升，20～40 cm土层子囊菌门的相对丰度下降；子囊菌门大多数为腐生菌，可以分解木质素、角质素等难降解的有机质，在养分循环中担任着重要角色［44-45］；酸杆菌门能够降解复杂的木质素和纤维素，为土壤提供养分，还会分泌植物激素IAA从而促进作物生长［46-47］， 变形菌包括了能与植物共生的固氮细菌，对土壤氮、磷、硫和有机质循环有重要作用［48］，本试验研究结果发现，海藻肥处理0～20和20～40 cm土层酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度提高，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度降低；葡萄籽肥处理后降低了0～20和20～40 cm土层酸杆菌门的相对丰度，提高了0～20 cm土层变形菌门的相对丰度，降低了20～40 cm土层变形菌门的相对丰度。土壤物种丰度聚类热图结果显示，海藻肥和葡萄籽肥处理后在属水平上细菌差异较小，真菌中被孢霉属（Mortierella）和酵母属（Guehomyces）明显增加，李发虎等［49］研究发现施入生物炭后增加了被孢霉科真菌比例，可促进土壤有机质和养分含量的提高，从而利于黄瓜根系生长并提高根系体积。被孢霉属是一类可以产生多烯不饱和脂肪酸，如花生四烯酸的真菌，被广泛应用于食品、饲料和医用领域［50］，还具有溶解土壤中磷的功能［51］，酵母属（Guehomyces）也属于有益菌，可以有效抑制致病菌对于植物的伤害，此外，酵母属菌种还有一定的重金属吸附作用，可以有效减少重金属对植物的伤害［52-53］。综上所述，生物有机肥的使用一定程度上对果园土壤的改良产生了积极的影响。

4 结论

生物有机肥（海藻肥和葡萄籽肥）处理后提高了树体的株高、冠径和产量，且果实品质优良；海藻肥处理后树体长势、叶丛枝和短果枝比例、平均单果质量以及果实品质均优于葡萄籽肥，但其公顷产量低于葡萄籽肥。

海藻肥处理后0～20和20～40 cm土层酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度提高，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度降低；葡萄籽肥处理后降低了0～20和20～40 cm土层酸杆菌门的相对丰度，提高了0～20 cm土层变形菌门的相对丰度，降低了20～40 cm土层变形菌门的相对丰度，拟杆菌门相对丰度的变化与变形菌门相反。值得注意的是，海藻肥处理后20～40 cm的第一大优势菌门是酸杆菌门，其他处理的第一大优势菌门是变形菌门。

子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）是土壤中含量最丰富的两大真菌群落，与45%有机肥处理相比较，对0～20 cm土层来说，海藻肥和葡萄籽肥处理均提高了子囊菌门的相对丰度，其相对丰度表现为G_1>F_1>E_1，降低了接合菌门的相对丰度，其相对丰度表现为E_1>F_1>G_1；对20～40 cm土层来说，海藻肥和葡萄籽肥处理均提高了接合菌门的相对丰度，其相对丰度表现为G_1>F_1>E_1，其中海藻肥处理提高了子囊菌门的相对丰度，较CK提高了56.88%，葡萄籽肥处理降低了子囊菌门的相对丰度。

海藻肥和葡萄籽肥处理后增加了0～20 cm土层细菌的多样性和丰富度，减少了真菌的丰富度和多样性，3种生物有机肥处理土壤细菌Simpson优势度指数以G最高，达到0.055 3；对于20～40 cm土层，海藻肥处理后减少了土壤细菌和真菌的丰富度和多样性；葡萄籽肥处理则提高了土壤细菌和真菌的丰富度和多样性。