李文超 张明艳 叶鹏 张育溎 靳亚鑫 田鹏宇 宋敏丽

摘    要：为了研究6-BA和NAA不同浓度配比对毛建草组织培养的影响，以叶片和叶柄为外植体，分别接种到同时含有0.5 mg/L 6-BA和不同浓度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培养基上，统计愈伤组织的个数并计算诱导率。结果发现，相同条件下，叶柄作为外植体时，愈伤组织的生长状况明显优于叶片;当0.5 mg/L 6-BA配比0.2 mg/L NAA时，叶柄长出愈伤组织的个数最多，诱导率达到100%，显著超过了其他组合。

关键词：毛建草;外植体;6-BA;NAA

文章编号：1005-2690（2021）22-0025-02       中国图书分类号：S531       文献标志码：B

毛建草又称毛尖、岩青兰，据《中药大辞典》记载，岩青兰可全草代茶，主治外感风热、头痛寒热、咳嗽、黄疸性肝炎[1-2]。近年来，采用不同的方法对毛建草的化学成分进行分析和鉴定[3-5]，已经发现毛建草具有多种药用价值，如抗癌、抗氧化[6]、保护心肌[7]等。

由于毛建草具有很高的经济价值和药用价值，利用植物组织培养技术加速培育毛建草尤为迫切。目前，张彦广利用萌蘖根部对毛建草进行了初步引种栽培[8]，刘俊等首次建立了毛建草的离体培养快繁体系[9]，宗越等对不同外植体诱导愈伤组织的效果进行了比较[10]，进一步确定了激素配比在诱导毛建草愈伤组织中的关键作用。本研究以毛建草的叶片和叶柄为外植体，尝试在缺乏茎段的条件下用材料充足的叶片和叶柄快速诱导愈伤组织，为毛建草的人工培育奠定基础。

1   材料和方法

1.1   试验材料

1.1.1   植物材料

在人工气候培养箱中生长4周的毛建草，取其幼嫩的叶片和叶柄作为外植体。

1.1.2   主要试剂

无菌水、无水乙醇、细胞分裂素6-BA、萘乙酸NAA、NaOH、蔗糖、琼脂。

1.1.3   主要仪器

电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、BIC-300人工气候培养箱、JB-CJ-1000FX洁净工作台。

1.2   试验方法

1.2.1   MS培养基配制

（1）根据培养基配方及需要配制的体积，计算各种药品和母液的用量，按照大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质、母液的顺序编号置于操作台上，按顺序量取各种母液于烧杯中。

（2）称取琼脂、蔗糖等固体物质放入烧杯中，量取去离子水于不锈钢容器中（体积约为培养基的80%），用电磁炉加热将水烧开。

（3）水开后，加入母液、琼脂、蔗糖等搅拌，防止粘锅，直至琼脂全部溶解。

（4）用1 mol/L的NaOH调节pH值到5.8，趁热分装，每瓶约40 mL。用棉塞封口后包扎好放入高压灭菌锅，灭菌20 min，待培养基自然冷却和凝固后备用。

1.2.2   外植体灭菌

挑选10片幼嫩、干净的毛建草叶片，连叶柄一起摘下，在流水中用软毛刷蘸上洗衣粉刷洗外植体并冲洗干净。在超净台中用无菌镊子将外植体放入无菌空瓶，加入70%酒精，轻轻摇晃30 s，然后用无菌水冲洗干净。将外植體转移到另一个无菌空瓶，加入浓度为30%的84消毒液，滴几滴吐温-80，轻轻摇匀后浸泡10 min;用无菌水冲洗3～4次，备用。

1.2.3   外植体接种

（1）将所需要的工具、无菌水和培养基放入超净工作台中进行紫外照射，30 min后关闭紫外灯并鼓风5 min。

（2）用酒精棉球擦拭双手、台面和接种工具，准备接种。

（3）将培养基瓶口在酒精灯附近打开并尽量在超净工作台靠近里面操作，镊子和解剖刀在酒精灯上从头到尾过火，尖端烧红，置于无菌的培养皿上冷却（接种刀具每用一次需重新灭菌）。

（4）将灭菌的叶片和叶柄用镊子夹出来，放到无菌的培养皿上，用解剖刀将叶片和叶柄分离，叶片切成边长为5 mm的正方形，叶柄切成5 mm左右的小段，接种到含有0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培养基上，每个瓶子接种3个叶片或叶柄，重复3次。接种完毕后，用封口膜封好并贴上标签，放入人工气候培养箱25 ℃光照培养，观察并记录数据。

2   结果与分析

将叶片、叶柄分别接入含有0.5 mg/L 6-BA配比不同浓度（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA的MS培养基上后，第7天观察发现，叶片没有明显变化，但是叶柄大部分有愈伤组织长出;第9天，叶柄全部长出愈伤组织，而叶片偶尔有愈伤组织长出。15 d后愈伤组织的生长情况见表1、表2。0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA对叶片愈伤组织的诱导效果极低，诱导率仅有11.1%。相比之下，这种激素配比对叶柄愈伤组织的诱导非常有效，3种处理愈伤组织的个数均显著高于叶片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA条件下，叶柄长出愈伤组织的个数最多，诱导率达到100%，明显高于其余两种处理，因此，叶柄作为外植体诱导愈伤组织的最适激素配比为0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3   结论与讨论

植物组织培养又称为植物克隆，是指通过无菌操作将植物体的各种结构材料即外植体，包括根尖、茎段、茎尖、幼叶、幼胚、花药等接种于人工配制的培养基上，在人工控制环境条件下进行离体培养的技术与方法。植物组织培养不仅速度快，而且可以摆脱自然地理环境和季节的限制，对繁殖系数低和经济价值高的植物品种具有重要意义。

在植物组织培养中，6-BA是一种常用、首选的细胞分裂素，具有促进外植体细胞分裂进而诱导不定芽产生的作用。6-BA可单独使用，也可与一定浓度的其他激素如NAA、IAA等联合使用。6-BA、NAA和（或）IAA的浓度配比因植物种类和外植体不同而不同。刘俊等建立的毛建草离体快繁体系中，采用0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA作為芽诱导培养基的激素配比。宗越用0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作为诱导愈伤组织的最佳激素配比。

在本试验中，发现0.5 mg/L 6-BA+（0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L）NAA对毛建草叶片愈伤组织的诱导几乎没有效果，诱导率极低，原因一方面可能是6-BA+NAA的浓度配比不利于叶片愈伤组织的诱导，另一方面可能是叶片较其他部位不易长出愈伤组织。相比之下，叶柄长出愈伤组织的个数明显超过叶片，其中，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA对叶柄愈伤组织的诱导率达到100%，因此，在茎段较少的情况下，可以用叶柄来代替茎段产生愈伤组织。由于材料数量的限制，参考宗越等以毛建草茎段为外植体时6-BA的最适浓度为0.5 mg/L，但是，因为外植体不同，诱导叶柄和茎段产生愈伤组织所需6-BA的最适浓度可能并不相同，有待进一步验证。

参考文献：

[1]中科院中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1997：378.

[2]丁聪，李远辉，康恒军.岩青兰的化学成分及药理学研究综述[J].药学研究，2013，32（11）：663-664.

[3]任冬梅，袁久荣.岩青兰化学成分的研究[J].中草药，1997（2）：74-76.

[4]任冬梅，娄红祥，季梅.岩青兰化学成分的研究（Ⅱ）[J].中国药学杂志，2005（22）：25-26.

[5]欧阳丹薇.岩青兰化学成分的研究[D].太原：山西医科大学，2006.

[6]郝娜，马伟伟，黄航君，等.岩青兰化学成分及抗氧化活性[J].河北大学学报（自然科学版），2018，38（6）：617-622.

[7]韩秀珍.岩青兰黄酮的心肌保护作用及机制研究[D].济南：山东大学，2008.

[8]张彦广.河北省野生花卉调查及部分种的引种栽培研究[D].北京：北京林业大学，2006.

[9]刘俊，孙瑞芬，耿牡丹，等.毛建草离体培养快繁体系的建立[J].北方农业学报，2017，45（6）：102-106.

[10]宗越，郭晓红，田旭平.毛建草茎段愈伤组织的诱导及继代培养试验[J].山西农业科学，2019，47（4）：507-509.