荆半夏胚性愈伤组织的诱导

2017-05-02李先良李居宁张喜才赵志常

江苏农业科学 2017年3期

李先良李居宁张喜才赵志常

摘要：以竹叶型荆半夏叶柄为外植体，研究不同培养基、激素配比、不同叶柄处理方式对愈伤组织诱导的影响。结果表明，单独添加2，4-D或6-BA均能诱导半夏叶柄愈伤组织，但诱导率较低，愈伤组织质量相对较差。叶柄不同部位对愈伤组织诱导有显著影响，叶柄下段适合愈伤组织诱导，黄化处理能提高叶柄愈伤组织诱导的效果。正交试验结果表明，4因素对半夏愈伤组织诱导影响从大到小为2，4-D浓度>叶柄位置>6-BA浓度>蔗糖浓度。从诱导率和愈伤组织质量考虑，取半夏叶柄下段接种于培养基MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖上進行培养，效果较好。

关键词：荆半夏；叶柄；胚性；愈伤组织；诱导；培养基；激素

中图分类号： S567.23+9.043文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0028-03

收稿日期：2016-08-16

基金项目：国家自然科学基金（编号：31471850）；湖北省荆门市科技局科学基金（编号：110588）。

作者简介：李先良（1976—），男，副教授，研究方向为园艺植物遗传改良和分子生物学。E-mail：libusher@sina.com。

通信作者：赵志常，副研究员，研究方向为热带果树遗传育种与分子生物学。E-mail：zhaozhichang2001@163.com。

半夏（Pinellia ternata）是天南星科多年生草本植物，主要分布于湖北省、四川省、河南省、贵州省、安徽省等地，其中产于湖北省荆州市的半夏被称为荆半夏，因色白、质坚实、粉性足等优点而被誉为上品。半夏是传统中药，据对558个处方分析，半夏出现频率位于第22位。半夏以块茎入药，含半夏生物碱、β-谷甾醇等成分[1-2]，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结等多种功效[3-4]。近年来，半夏蛋白被发现还具有抗早孕、抗肿瘤[4-6]、抗心律失常、抗衰老[7-8]的特殊功效。半夏市场需求量大，市场价格比较稳定，野生半夏满足不了市场需求，人工栽培逐渐发展起来。人工栽培半夏种茎价格较高，目前湖北省半夏栽培使用种茎量为4.5～6 t/hm2，需 9万～12万元/hm2。因此，降低种茎成本可以有效提高半夏人工栽培效益。

[JP2]半夏自然状态下可进行有性繁殖和无性繁殖。有性繁殖形成的种子发芽率低，除了种子外，半夏通过块茎形成珠芽来进行无性繁殖，一般2～3年生的块茎会形成1～2个珠芽，无性繁殖效率较低。因此，组织培养作为一种高效繁殖方法，将其运用于半夏种苗或种茎的培育一直备受重视。半夏主要通过器官发生途径成苗，但器官发生途径形式至少有3种类型，[JP3]一是外植体直接成苗，通常也被称为一次成苗；二是外植体先形成带芽的球状体，该球状体经过进一步培养后成苗；三是外植体形成比较明显的愈伤组织，该愈伤组织经过分化培养后成苗。[JP]

[JP2]高质量愈伤组织可以建立高效再生体系，在细胞培养和转基因体系建立等方面也具有基础性作用。高质量愈伤主要特征是良好胚性，具有较强的再生能力，从外观上看，高质量愈伤表现为颗粒状、有光泽，一般将高质量愈伤组织称为胚性愈伤组织。从半夏愈伤组织诱导所用外植体看，主要是块茎[9-13]、叶柄[14-18]及叶片[19-21]。关于最佳外植体的筛选，现有研究结果存在一定差异，这可能是由外植体基因型和筛选培养基不同造成的。本研究以荆半夏竹叶形半夏叶柄为外植体，探索叶柄位置、黄化处理、培养基类型、蔗糖浓度、生长调节物质对胚性愈伤诱导的效果，为建立高效组培再生体系建立基础。[JP]

1材料与方法

1.1材料

试验材料为荆半夏无菌苗叶柄。无菌苗通过荆半夏叶柄消毒接种到培养基 MS+1.0 mg/L 6-BA上，在温度（26±2） ℃、光照周期12 h/d、光照度 2 000～3 000 lx下培养30 d即可获得。

1.2方法

取将无菌苗叶柄下段平躺接入单独添加了2，4-D（浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）或6-BA（浓度为0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L）的MS培养基，比较2，4-D和6-BA对半夏愈伤组织诱导的效果；取叶柄下段平躺接入分别添加15、30、45、60、75、90 g/L蔗糖的MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基，比较蔗糖浓度对愈伤组织的诱导效果；取暗培养 10 d 和正常光照的无菌苗，取叶柄分上、中、下段，分别平躺接入培养基 MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，考察黄化处理对愈伤组织诱导效果；以不同浓度2，4-D、6-BA、蔗糖、不同叶柄位置为因素，设置4因素3水平L9（34）正交试验，各因素水平见表1，研究各因素水平对愈伤组织诱导效果。以上各处理每瓶各接5个，每处理重复15次，培养25 d统计愈伤组织诱导率。

2结果与分析

2.16-BA、2，4-D对半夏叶柄愈伤组织诱导效果

从表2可以看出，单独添加6-BA或2，4-D均能诱导叶柄形成愈伤组织，但诱导率及愈伤组织状态都有较大差别。添加2，4-D诱导率较高，出愈时间较长，愈伤组织质地松软。添加6-BA出愈较快，愈伤组织量较少，颜色呈现黄绿色，质地较硬，后期愈伤组织出现再分化成苗的现象。

2.2蔗糖对半夏愈伤组织诱导的效果

从表3可以看出，低浓度（15～60 g/L）蔗糖处理下，增大蔗糖利于愈伤组织诱导，叶柄膨大和出现愈伤组织的时间提前，而且愈伤组织在叶柄两端分布较均匀，相对疏松且颜色呈现黄白色。当浓度过大（60～95 g/L）时，可能渗透压过大，会引起外植体死亡。

2.3黄化处理对愈伤组织诱导的影响

从表4可以看出，叶柄不同部位对愈伤诱导率影响差异明显，下部诱导率最高，其次是中部，上部最低，但对愈伤质量影响不大。这说明叶柄下段可能发育程度较低，脱分化相对容易。黄化处理诱导率提高，特别是对中上部叶柄，效果最为明显，黄化处理后叶柄上、中、下段诱导率差异变小，这有利于扩大合适外植体来源。

2.4荆半夏胚性愈伤组织诱导条件的不同因素正交试验

由表5可以看出，4个因素对无菌苗叶柄愈伤组织诱导的影响作用大小为2，4-D浓度>叶柄部位>6-BA浓度=蔗糖浓度，最优组合为A2B3C3D3，即采用葉柄下段为外植体，培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+60 g/L蔗糖。但从愈伤组织质量来看，6-BA浓度过高会使愈伤紧密，如不及时继代容易分化成苗。

3结论与讨论

本研究以竹叶形荆半夏叶柄为外植体，考察不同部位叶柄、黄化处理2个会影响外植体生理状态的因素及2，4-D浓度、6-BA 浓度、蔗糖浓度对愈伤组织诱导率和愈伤组织质量的影响。研究的4个因素中，2，4-D浓度对半夏叶柄愈伤组织诱导影响较大，这与章伟标等的研究结果[10，14]一致。当2，4-D浓度较高而6-BA浓度较低时，诱导的愈伤组织往往呈现暗黄色和水浸状，质地软。当6-BA浓度较高而2，4-D 较低时，形成的愈伤组织呈现黄白色，质地硬而板结。因此，2，4-D和6-BA合适的浓度是形成胚性愈伤组织的关键。

半夏叶柄的位置对愈伤组织诱导也具有较大的影响。从诱导率和和愈伤组织质量两方面看，叶柄下段比较合适。黄化处理可改变叶柄的生理状态，从而影响其愈伤组织诱导。经过黄化处理的试管苗上、中、下段愈伤组织诱导率差异缩小，与未经黄化处理的叶柄比较，上中段叶柄诱导率有所提高。蔗糖在培养基中的作用除了作为碳源外，另一个作用是提供合适的渗透压。在一定浓度范围内，提高蔗糖浓度可以增加叶柄两端膨大速度和程度，这可能主要是由培养基渗透压提高造成的。

[HS2]参考文献：

[1]秦文娟，王瑞，温月笙，等. 掌叶半夏化学成分的研究[J]. 中草药，1995，25（1）：3-6.

[2]吴皓，李伟，张科卫，等. 半夏药材鉴别成分的研究[J]. 中国中药杂志，2003，28（9）：836-839.

[3]白权，李敏，贾敏如，等. 不同产地半夏祛痰镇咳作用比较[J]. 中国药理学通报，2004，20（9）：1059-1062.

[4]李玉先，刘晓东，朱照静.半夏药理作用的研究述要[J]. 辽宁中医学院学报，2004，6（6）：459-460.

[5]张科卫，吴皓，李伟. HPLC同时测定半夏药材中鸟次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷的含量[J]. 药物分析杂志，2005，25（5）：487-489.

[6]郑国灿. 半夏提取液的抗肿瘤性研究[J]. 四川中医，2004，22（9）：9-11.

[7]张小丽，谢人明，冯英菊. 四种中药对血小板聚集性的影响[J]. 西北药学杂志，2000，15（6）：260-261.

[8]蒋文跃，杨宇，李燕燕. 化痰药半夏、瓜英、浙贝母、石曹摘对人鼠血液流变性的影响[J]. 中医杂志，2002，43（3）：215-216.

[9]罗华彦，庭玉凤，宋萍，等. 半夏快速繁殖体系的研究[J]. 植物生理学通讯，2005，41（6）：777-778.

[10]章伟标，王姿云，张莹莹，等. 半夏疏松愈伤组织诱导及高产半夏蛋白悬浮株系筛选[J]. 浙江理工大学学报，2011，28（5）：800-803.

[11]苏新.半夏愈伤组织的诱导和植株再生的研究[J]. 中国中药杂志，1989（14）：15-17.[HJ1.75mm]