戈娜 林韦翰 黄静婷 古秀芬 吴瑕

摘要 目的：应用网络药理技术，分析糖尿病肾病进展相关代谢物及其分子靶标和作用机制。方法：基于前期代谢组学筛选出的与糖尿病肾病进展高度相关的代谢物，使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）、Pubchem数据库，检索提取与代谢物有关的有效靶标基因，并进行通路分析;采用Cytoscape3.2.1软件Cluego进行代谢物基因靶标的通路、生物过程、细胞组分、分子功能进行富集分析，并绘制网络图。结果：本研究共分析了31个与糖尿病肾病进展相关的代谢物;应用KEGG和Pubchem数据库，共提取了31个代谢物，涉及代谢通路82条，涉及基因靶标252个;代谢物的基因靶标共涉及157条通路。代谢物基因靶标主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等代谢物。基于代谢物-基因靶标网络图核心节点进行解析，提示谷氨酸是连线最多的节点，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氪酸等;连线最多的通路包括糖酵解/糖異生，脂肪酸降解、基酸合成等;最集中的基因靶标为NOS2、NOS3、ALDH7A1等。基因靶标的富集分析结果表明，代谢物基因靶标主要集中在氨基酸代谢、脂肪酸、氪代谢等。基因靶标涉及的细胞组分分析提示糖尿病肾病进展主要与线粒体、突触膜、突触前膜等细胞部位异常有关。疾病进展涉及的分子功能包括氨基酸、羧酸、维生素拼接等。结论：通过对代谢物基因靶标进行深入的网络分析提示，氨基酸代谢异常在糖尿病肾病进展中至关重要，是参与机体免疫代谢调节的关键节点。

关键词 糖尿病肾脏病;氨基酸代谢;分子网络机制;靶标

中图分类号：R285

文献标识码：A

doi：10.3969/[J].isn.1673-7202.2021.21.009

全球糖尿病及糖尿病肾病的发病率连年上升加重经济负担，严重威胁人类健康。慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）是糖尿病的最主要并发症之一，随着糖尿病发病的不断增加，CKD在成年糖尿病人群的发病率，20002007年逐年增加，并且中国糖尿病患者的CKD发病率（10.9%）显著高于全球平均发病率。美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）指出，20%～40%的糖尿病患者将进展为CKD2。中国CKD患者的发病率从2010年的19.5%攀升至2015年的24.3%。CKD还是心血管疾病及过早死亡的危险因素。而2型糖尿病合并CKD患者的死亡风险是单纯2型糖尿病或者单纯CKD患者的2倍多。糖尿病是重要的代谢性疾病，疾病进展过程中存在明显糖、脂、氨基酸、核酸代谢异常。肾脏是机体排泄代谢产物的重要器官，对机体的代谢调节有重要作用。机体代谢异常在糖尿病肾脏损伤过程中的作用机制尚不十分清楚。异常变化的代谢物是评估疾病的标志物，抑或是参与疾病进展的致病因素，尚不明确。我们前期应用代谢组学研究发现，在疾病进展过程中一系列氨基酸、脂肪酸、核酸代谢产物，随疾病进展显著异常。网络药理学是随系统生物学发展而渐兴之技术，其通过分析现有数据库的信息资料，结合实验中获取的数据，利用算法，系统、整体地揭示疾病疾病、疾病表型靶点蛋白、靶点蛋白-药物、药物-药物之间的关联关系，从网络层面解析分子靶标在疾病中的作用机制。

本研究拟应用网络药理学技术，对前期筛选出的与糖尿病肾病进展相关的代谢物进行基因靶标的提取，并基于京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pubchem数据库对基因靶标涉及的通路及生物功能进行富集分析，以期进一步阐释疾病进展过程中代谢物参与疾病进展的分子机制。

1资料与方法

1.1疾病进展相关代谢物基因靶标的提取及整理提取基因靶标数据库包括：KEGG Compound Database（https：//www.kegg.jp/kegg/ccompound/）

Pubchem（https：//pubchnem.ncbl.nim.n将筛选出的与疾病进展相关代谢物以化合物名字和Inchikey为检索词，在Pubchem、KEGG数据库中搜集与人类有关联的糖尿病肾病代谢物基因靶标。应用KEGG数据库，检索与所有代谢产物相关的靶标基因，在检索不到代谢产物的记录时，参考Puchen内该代谢产物所有同义词，并在KEGG Compound Database内进行检索;所有检索结果需要校对代谢产物的化学式，以确保代谢产物正确。依据Pubchem数据库检索所有疾病代谢产物，并收录“Bioactivities'”选项下有效结果的靶标基因;将检索KEGGCompoundDatabase与Pubchem数据库所得结果汇总，删除相同靶标基因。

1.2基于Cytoscape构建代谢物、通路、基因靶标网络图将代谢物、基因靶标导入Cytoscape绘制代谢物-基因靶标网络图，分析基因靶标聚集情况。将代谢物输人KEGG PATHWAY Database（htps：//ww.keg.jp/kegg/pathway.html），获取代谢物参与通路情况。应用Cytocape绘制代谢物-通路网络图，明确代谢物参与通路情况。将代谢物、涉及通路、基因靶标统一导人Cytoscape，绘制代谢物通路-基因靶标网络图。

1.3疾病进展相关代谢物基因靶标网络构建及富集分析将基因靶标导人Cytosacape3.7.2软件，应用CLUEGO插件，选择Homo Sapiens限定范围，构建网络。应用基因本体（Gene Ontology，GO）生物过程（Bilogical Process，BP）或KEGG pathway进行通路分析及生物功能分析，获取通路及生物功能可视化网络。网络图中，P值越小，圆圈越大，圆圈节点代表代谢物相关的基因靶标，边代表靶标之间的联系。

2结果

2.1疾病进展相关代谢物的筛选基于课题组前期代谢组学结果，选取糖尿病肾病进展过程中与肾小球滤过率（Glomerular FiltrationRate，GFR）紧密相关的31种代谢物，分别为色氨酸、肉毒碱、葡萄糖、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、硫酸脱氢表雄酮、甜菜碱羟丁酸、尿酸、γ丁酰甜菜碱、胆碱、苯丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、辛酰基肉毒碱、鸟氨酸、叫哚乙酸、马尿酸、瓜氨酸、N.乙酰肌肽、犬尿氨酸、吲哚乳酸、硫酸吲哚酚、犬尿喹啉等。见表1。

2.2疾病进展相关代谢物基因靶标的提取及整理

31种代谢物中，在KEGG数据库中共提取到269个基因靶标，在Pubchem数据库中共提取69个，去掉代谢物之间重复及数据间重复的靶标，共计252个代谢物基因靶标。绘制代谢物与基因靶标相互关系网络图，提示基因靶标主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、胆碱、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代谢物。见图1。

2.3疾病进展相关代谢物涉及的通路将31种代谢物输人KEGG Pathway数据库，获取代谢物涉及通路情况，发现31种代谢物共参与82条通路。绘制代谢物与通路间关系网络图，提示谷氨酸涉及的通路最丰富，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺次之。见图2。

2.4疾病进展相关代谢物、基因靶标及靶标通路情况将31种代谢物的252种基因靶标输入KEGG Pathway数据库，获取代谢物基因靶标涉及通路情况，共获取基因靶标通路157條。应用Cytoscape软件构建代谢物-基因靶标-通路图。基于网络图的连线Degree对图中的核心节点解析提示，谷氨酸是连线最多的节点，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;连线最大的通路为糖酵解/糖异生脂肪酸降解、氨基酸合成、烟酰胺代谢、视黄醇代谢tRNA生物合成、丙酮酸代谢;最集中的基因靶标为NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

见图3。

2.5疾病进展相关代谢物基因靶标富集分析

2.5.1基因靶标涉及通路富集分析使用Cytoscape的插件Cluego对基因靶标进行富集分析，通路的富集结果表明，与肾病进展相关代谢物的基因靶标主要集中在氨基酸代谢、脂肪酸、氮代谢、核酸代谢方面，其中色氨酸代谢、脂肪酸降解、嘧啶代谢、酪氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢靶标最为丰富。见图4。

2.5.2基因靶标涉及BP富集分析BP富集结果

表明，与肾病进展相关的代谢物基因靶标主要集中在细胞的氨基酸代谢、小分子代谢、有机酸代谢、有机氮复合物代谢等。见表2，图5。

2.5.3基因靶标涉及细胞组分富集分析细胞组分（Cellular Component，CC）的富集结果表明，疾病进展代谢物基因靶标涉及的细胞部位包括：线粒体突触膜、突触前膜、突触、轴突末端、终扣、树突胞质、过氧化物酶体、质膜、外侧瞄蛋白成分等细胞部位。见图6，表3。

2.5.4基因靶标涉及分子功能富集分析分子功能（Molecular Function，MF）富集分析结果提示氨基酸、羧酸、维生素拼接，转移酶活性、配体活性、谷氨酸受体活性、NAD活性、氧化还原酶活性、肉毒碱乙酰基转移酶活性变化均与糖尿病肾病进展过程相关。见表4，图7。

3讨论

本研究在前期研究基础上，筛选出31种与糖尿病肾病患者GFR下降密切相关的代谢物，基于KEGG、Pubchem数据库，提取代谢物的活性基因靶标。采用KEGG通路分析及Cytoscape插件CLUEGO进行基因靶标的分析。

本研究发现，提取的糖尿病肾病进展相关代谢物基因靶标主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、胆碱、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代谢物。基于代谢物-基因靶标-网络图的关联度对图中的核心节点进行解析，提示谷氨酸是连线最多的节点，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;连线最多的通路为糖酵解/糖异生，脂肪酸降解、氨基酸合成、烟酰胺代谢、视黄醇代谢、RNA生物合成、丙酮酸代谢;最集中的基因靶标为NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

基因靶标的富集分析结果表明，与肾病进展相关代谢物的基因靶标主要集中在氨基酸代谢、脂肪酸、氮代谢、核酸代谢方面，其中色氨酸代谢、脂肪酸降解、嘧啶代谢、酪氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢靶标最为丰富。BP方面，与肾病进展相关的代谢物基因靶标主要集中在细胞的氨基酸代谢小分子代谢、有机酸代谢、有机氮复合物代谢等。基因靶标涉及的CC分析提示糖尿病肾病进展主要与线粒体、突触膜、突触前膜、突触、轴突末端、终扣、树突胞质、过氧化物酶体、质膜、外侧瞄蛋白成分等细胞部位异常有关。疾病进展涉及的MF包括氨基酸、羧酸、维生素拼接，转移酶活性、配体活性、谷氨酸受体活性、NAD活性、氧化还原酶活性、肉毒碱乙酰基转移酶活性变化均与糖尿病肾病进展过程相关。

本研究发现异常的氨基酸代谢参与糖尿病肾病的进展过程，该结果与近年来报道的氨基酸具有调节中枢能量代谢、氧化还原平衡、表观遗传修饰的作用相一致。研究发现，机体循环氨基酸可以作为2型糖尿病患者大血管、微血管、全因死亡的危险因素。低浓度的酪氨酸是独立于肾功能损伤以外的预测2型糖尿病患者微血管并发症的标志物。氨基酸参与机体细胞功能的发挥，促进机体ATP生成核苷酸合成及氧化还原平衡的维持。氨基酸同时参与机体免疫细胞功能的调节，参与癌症、感染以及代谢性疾病的发生。氨基酸代谢促进糖酵解和TCA循环，以及线粒体脂肪酸氧化（FAO），进一步推动线粒体代谢和ATP的产生，谷氨酰胺支持代谢重构，参与Th1和Th17细胞的分化调节”。此外，支链氨基酸可通过刺激葡萄糖摄取促进糖酵解以支持免疫细胞的代谢重编程）。丝氨酸也促进线粒体代谢。氨基酸调控机体氧化还原代谢，对维持氧化还原平衡至关重要。代谢物基因靶标CC分析的结果提示线粒体、突触、轴突、终扣、树突等细胞部位富集显著，提示糖尿病肾病进展过程中，突触传递、树突、轴突等神经递质信号传递起重要作用。近年发现，氨基酸及其代谢物除了参与机体免疫代谢调节，其下游代谢物多为神经递质，参与神经传导，是免疫介导的重要物质，参与机体的免疫代谢。诸如色氨酸下游的血清素、褪黑素、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、喹啉酸，酪氨酸下游的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素，组氨酸下游的组胺，谷氨酸下游的GABA等均可由免疫细胞分泌，调节机体的炎症状态，参与免疫相关疾病的发生综上所述，通过对代谢物基因靶标进行深入的网络分析提示，氨基酸代谢异常在糖尿病肾病进展中至关重要，是参与机体免疫代谢调节的关键节点。

参考文献

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