尹磊淼

摘要 利用表面等离子共振现象制备的生物传感技术具有无标记、灵敏度高、通量大、特异性强，样品耗损少等优点，在生命科学等众多学科中得到了广泛的关注和应用。近年来该技术也被运用在不少中医药研究的重要领域。本文简要介绍了表面等离子共振原理，总结并评述了在中医药新靶标发现、优效小分子寻找等方向的研究进展和前景。

关键词 表面等离子共振;中医药;针灸;靶标;生物传感器;机制研究

Abstract Biosensor technology based on surface plasmon resonance （SPR） phenomenon has been widely concerned and applied in recent years because of its advantages，such as no labeling，sensitivity，high-throughput，specificity，low sample consumption，etc.In the study of the mechanism of traditional Chinese medicine （TCM），SPR biosensor technology has also been used in many fields in recent years.In this paper，the principle of SPR is briefly introduced.The research progress and prospect in the fields，including the new target discovery of TCM and searching for small molecules with best performance，are summarized and reviewed.

Keywords Surface plasmon resonance （SPR）; Traditional Chinese medicine; Acupuncture; Target; Biosensor; Mechanism research

中圖分类号：R285.5;R2-03文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.008

随着全国中医药大会召开和《中共中央国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》正式发布，我国蓬勃发展的中医药事业也迈入新的历史时期[1]。科学化思维和工具的合理运用对中医药发展十分关键。因此，利用新技术方法推进并挖掘中医、中药蕴含的科学机制是当前重要任务之一[2]。目前对医学和药物的研究已逐渐从整体宏观水平进入到微观细胞、分子水平。故确定中医药优势病种的效应蛋白、响应基因等分子间的相互作用，深入围绕中医药关键靶点开展特异性信号通路研究等，就成为当前中医药科学机制研究的当务之急。

基于表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）的检测技术是一种检测分子间相互作用关系的无标记、高灵敏度、高通量、特异性强、低耗量的生物传感技术，是研究分子间相互作用最重要方法之一，已经在生命科学等众多领域得到广泛应用[3-4]。本文总结回顾了SPR原理，重点评述SPR技术在中医药新靶标发现及作用机制、寻找中药优效小分子等方面研究进展，并对前景进行展望。

1 SPR原理

SPR是一种物理现象，指当一束光照射到镀在玻璃表面的金属膜上发生全反射时，当入射光波向量与金属膜内表面电子的振荡频率相一致时，金属电子吸收光能发生共振，从而使得被反射光的强度达到最小[5-6]。而SPR生物传感器就是利用该现象制备的光学检测系统，可对各种生物分子间相互作用（如蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子、蛋白质-核酸、核酸-核酸等）进行检测[7]。

在SPR生物传感器检测分子相互作用过程中，一般分子量较大的蛋白被固定在传感芯片的表面（称固定相，如中医药相关效应蛋白），另一种分子在溶液流过表面（称流动相，如溶解的中药有效成分），如二者有相互作用（即改变芯片表面结合的物质质量限度为1 pg/mm2），则导致表面折射率变化并引起SPR角度的变化[8]。见图1。通过实时检测上述变化不但能明确分子间是否发生特异性结合，还可精确获得平衡解离常数（KD值，代表平衡时受体配体复合物解离程度，数值越小说明亲和力越大）等动力学信息[9]。

2 SPR技术在中医药新靶标发现及作用机制中应用

在中医药新靶标发现和作用机制研究方面，SPR技术对比传统技术（如同位素标记的放射配体受体分析法、基于抗体识别的免疫共沉淀方法等）常显示出安全、快速和特异性强等优势。研究发现针刺“大椎”“风门”“肺俞”等穴位后可显著增加哮喘模型大鼠肺组织金属硫蛋白-2（Metallothionein-2，MT-2）蛋白水平[10]。利用Pull down方法和质谱检测发现MT-2在气管平滑肌细胞上结合蛋白是肌动蛋白结合蛋白-2（Transgelin-2，TG2）[11]。利用SPR技术验证针刺抗哮喘效应蛋白MT-2和相应靶标TG2相互作用过程如下：将TG2蛋白作为固定相，依次把TG2抗体（阳性对照）、MT-2全长蛋白、MT-2的α、β亚基作为流动相，检测获得MT-2和TG2蛋白的KD值为442 nmol/L，而2个亚基均无法单独结合靶标蛋白[12]。上述结果提示了MT-2蛋白三维结构完整性在靶标结合中起重要作用[12]。

SPR技术还可用于确认中药小分子靶点及其在相关疾病中作用机制。见表1。如牛蒡子主要成分牛蒡子苷元能够通过增加足细胞黏附来保护高糖所致的细胞损伤，从而有效改善临床糖尿病肾病的症状[13-14]。利用药物亲和反应靶稳定性方法（Drug Affinity Responsive Target Stability Assay）发现牛蒡子苷元可通过激活蛋白磷酸酶2A（Protein Phosphatase 2A，PP2A）缓解炎性反应从而保护肾脏。利用SPR技术确认牛蒡子苷元和PP2A存在较强结合，KD值为0.662 μmol/L[14]。苏木是传统活血化瘀中药，关键活性成分为苏木酮A。通过构建带有生物素标记的探针，发现苏木酮A发挥抗神经炎性反应的作用靶点为次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶（Inosine Monophosphate Dehydrogenase 2，IMPDH2），利用SPR技术检测苏木酮A和IMPDH2靶标的KD值为3.944 nmol/L[15]。小檗碱是从黄连等中草药中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，具有抗炎、调节脂肪代谢等多种药理作用，然而相应生物学机制仍然不清楚[16]。利用Discovery Studio 2017 R2反向筛选小檗碱的潜在靶点是血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2），经SPR技术确认小檗碱和VEGFR2在体外有良好的结合，KD值为0.65 μmol/L[17]。应用荧光共振能量转移技术（Forster Resonance Energy Transfer，FRET），从23个小分子中筛选出小檗碱是潜在的凝血酶抑制剂，两者特异性结合KD值为16.39 μmol/L[18]。果胶是人参主要有效成分之一，人参果胶RG-I-4能够特异性地与半乳凝集素-3的糖识别结构域结合来抑制活性，KD值为22.2 nmol/L[19]。研究发现齐墩果酸等三萜类天然产物能够和埃博拉等病毒的膜蛋白HR2结构域结合，实现光谱抗感染作用。SPR技术检测发现先导化合物Y11可和HR2结合，KD值为5.4 μmol/L[20]。甘草成分之一芹糖甘草苷能够激活TGF/p38MAPK通路提高盐皮质激素受体蛋白表达，SPR技术检测发现芹糖甘草苷和盐皮质激素受体结合KD值为0.11 μmol/L[21]。

3 SPR技术在寻找优化中药小分子中应用

新药研发过程中，针对靶标蛋白的活性化合物筛选尤为关键。中药具有经过临床验证的良好功效且不良反应小，是有效化合物筛选的理想来源之一[22]。而SPR技术通量高（常规96孔或384孔进样）、特异性强，对于候选小分子纯度、溶解度（可含10%DMSO）要求不高，因此可以显著地提高分析效率[23]。SPR技术和中药分子库结合有效突破了传统药筛方法制约，减小筛选盲目性和工作量，提高药物筛选效率和成功率[24]。

应用SPR技术可通过检测靶标和小分子相互作用的KD值大小来快速筛选先导化合物。如针对炎性反应递质半胱氨酰白三烯合成的限速酶5-脂氧酶（5-lipoxygenase），通过分子对接和药效团构建模块进行计算机虚拟筛选后，利用SPR技术确认来源于17种中药的11个黄酮类小分子能与5-脂氧酶结合[25]。以人表皮生長因子受体（Epithelial Growth Factor Receptor，EGFR）为靶标，利用SPR技术从新疆紫草所含的4种柰醌类活性成分中筛选出一种潜在的EGFR抑制剂2β-二甲基丙烯酰紫草素，KD值为2.31 μmol/L[26]。通过SPR技术分析确认结合小分子的作用方式和共性规律，上述结果均为开发靶向5-脂氧酶或EGFR的新药研发提供思路和方法。

SPR技术还可通过和质谱等技术共同配合，快速筛选相应小分子。针对核受体超家族的核心成员维甲酸X受体α（Retinoid X Receptor α），将中药淫羊藿抗炎活性馏分与该靶标蛋白共同孵育，利用含His标签的重组蛋白进行Pull down捕获结合小分子，进一步利用高效液相色谱仪、核磁和质谱识别作用分子[27]。最终利用SPR技术检测发现宝藿苷I和维甲酸X受体α能够结合，KD值为8.6 μmol/L[27]。将肿瘤坏死因子受体1（Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1）做固定相，筛选获得有结合小分子后，利用质谱确认为大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷，KD值为376 nmol/L[28]。针对乳腺癌新靶标14-3-3τ蛋白，先通过液相色谱-荧光检测方法进行筛选，从82个不同类别的天然化合物中获得苯乙醇苷类等17种化合物，通过SRP技术确认齐墩果酸、牛蒡子苷等10个特异性结合化合物[29]。分别将脂多糖和含胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序的寡脱氧核苷酸（CpG DNA）固定在SPR芯片上，从114种中药候选小分子中发现地骨皮乙素是有效的脂多糖和CpG DNA双靶点抑制剂[30]。

4 SPR技术在中药小分子药代动力学研究中应用

在药代动力学研究方面，血清白蛋白对药物小分子的吸收、结合起着关键作用。以SPR技术为核心的检测平台从黄芩中快速筛选出了针对人血清白蛋白的11个异黄酮类小分子和9个黄芪皂苷类小分子[31]。利用SPR技术平台将人血清白蛋白固定在检测芯片表面，检测发现紫草素KD值为21.24 μmol/L[32]。牛磺熊去氧胆酸钠与牛血清白蛋白存在确定的相互作用，KD值为0.547 μmol/L[33]。双黄连注射液中的4种类黄酮（黄芩素、黄芩苷、灯盏花乙素和白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）均能够和牛血清白蛋白结合，KD值范围在（4～30）×10-4 M[34]。上述结果均有助于提示紫草素、牛磺熊去氧胆酸钠等中药小分子可和血清白蛋白有效结合，从而借助血清白蛋白运输到达作用靶点。基于SPR技术的药代动力学特性评价可以有效补充相关中药小分子与其药理靶点相互作用关系。

5 总结和展望

中医药是一个复杂的体系，但常常由于效应物质和作用靶点不明确而难以深入揭示其治疗疾病的分子机制[35]。“工欲善其事，必先利其器”。以SPR为代表的各种生物传感技术以其无标记、灵敏度高、筛选通量大、特异性强，耗损少等优点，逐渐成为中医药机制研究中的重要工具之一。目前SPR技术已经在中医药新靶标和潜在作用机制发现、优效中药小分子寻找等多方面获得了不错的成绩。结合确有临床疗效的中医药方法，也随着SPR技术本身的不断发展与完善，相信必将在今后的中医药机制研究中有更广泛的应用。

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（2020-05-10收稿 责任编辑：徐颖）