邓娅 张咪 丛子青 张梦瑶 王贞丽 姚如永

[摘要] 目的 探讨葛根素对脂多糖（LPS）诱导小鼠急性肾损伤的改善作用及其相关机制。

方法 将24只BALB/C小鼠随机分为4组，葛根素组以50 mg/kg葛根素灌胃，地塞米松组（阳性对照）腹腔注射5 mg/kg的地塞米松，模型组和对照组灌胃给予同等容量的生理盐水。葛根素组和地塞米松组小鼠预防性给药1 h后，腹腔注射10 mg/kg LPS刺激12 h。采用苏木精-伊红（HE）染色观察各组小鼠肾组织形态学改变，同时检测肾功能指标血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的含量，Western blotting法检测肾组织中炎症蛋白诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶2（COX2）的表达。

结果 与对照组比较，LPS诱导急性肾损伤小鼠肾组织中可见肾小管坏死中心的产生，血清中BUN和Cr的水平显著升高（F=51.55、102.75，P<0.01），血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量显著增加（F=3 338.15、1 226.85，P<0.01），肾组织中炎症蛋白iNOS和COX2的表达显著升高（F=21 682.77、4 497.00，P<0.01）;葛根素预防给药1 h能显著改善LPS引发的上述变化（P<0.01）。

结论 葛根素对LPS诱导的急性肾损伤具有明显的改善作用，同时可明显减少炎症因子的释放及降低炎症蛋白的表达，提示抗炎可能是葛根素治疗急性肾损伤的药理学基础。

[关键词] 葛根素;脂多糖类;急性肾损伤;炎症

[中图分类号] R285;R692.5

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0870-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.202

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20211230.1017.008.html;2021-12-30 14：59：05

EFFECT OF PUERARIN IN IMPROVING ACUTE KIDNEY INJURY AND RELATED MECHANISMS

DENG Ya， ZHANG Mi， CONG Ziqing， ZHANG Mengyao， WANG Zhenli， YAO Ruyong

（Department of Basic Medicine， Dazhou Vocational College of Traditional Chinese Medicine， Dazhou 635000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of puerarin in improving lipopolysaccharide （LPS）-induced acute kidney injury and related mechanisms.

Methods A total of 24 BALB/C mice were randomly divided into puerarin group （50 mg/kg puerarin by gavage）， dexamethasone （positive control） group （intraperitoneal injection of 5 mg/kg dexamethasone）， model group （an equal volume of normal saline by gavage）， and control group （an equal volume of normal saline by gavage）. At 1 hour after prophylactic administration， the mice in the puerarin group and the dexamethasone group were given intraperitoneal injection of LPS （10 mg/kg） and were stimulated for 12 hours. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of renal tissue， and the levels of the renal function markers blood urea nitrogen （BUN） and creatinine （Cr） were also measured. ELISA was used to measure the serum level of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6）， and Western blotting was used to measure the protein expression of inducible nitric oxide synthase （iNOS） and cyclooxygenase-2 （COX2） in renal tissue.

Results Compared with the control group， the mice with LPS-induced acute kidney injury showed the formation of renal tubular necrosis in renal tissue and significant increases in the serum levels of BUN and Cr （F=51.55，102.75;P<0.01）， the serum levels of the inflammatory factors TNF-α and IL-6 （F=3 338.15，1 226.85;P<0.01）， and the protein expression levels of iNOS and COX2 in renal tissue （F=21 682.77，4 497.00;P<0.01）. Prophylactic administration of puerarin for 1 hour significantly improved the above changes induced by LPS （P<0.01）.

Conclusion Puerarin can significantly improve LPS-induced acute kidney injury and reduce the release of inflammatory factors and the expression of inflammatory proteins， suggesting that anti-inflammation is the pharmacological basis of puerarin in the treatment of acute kidney injury.

[KEY WORDS]puerarin; lipopolysaccharides; acute kidney injury; inflammation

葛根是一种古老的常用传统中药，张仲景以葛根汤治“项背强”。葛根素是从豆科植物野葛或甘葛藤干燥根中提取的异黄酮类物质，具有抗炎[1]、调脂[2]、抗氧化[3]等一系列药理作用，临床上主要用于辅助治疗冠心病、高血压等心血管疾病[4-5]。急性肾损伤（AKI）是涉及多学科的临床常见危重病，由多种病因（缺血、炎症、肾毒性等）导致肾小管上皮损伤，从而引发肾功能短期急性减退[6-9]。目前关于葛根素对AKI的保护作用及相关机制研究并不深入。故本研究选用炎症刺激剂脂多糖（LPS）构建小鼠AKI模型[10-11]，探讨葛根素对AKI的改善作用及相关机制。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 选择24只雄性健康BALB/C小鼠，体质量为（18±22）g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。

1.1.2 试剂 葛根素购自南京泽朗生物科技有限公司，纯度≥98.5%（HPLC），分子式C 21H 20O 10，分子量432.38;地塞米松购于天津天药药业股份有限公司;LPS以及抗体诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶2（COX2）和GAPDH均购于美国Sigma公司;二抗购于美国CST公司;ECL化学发光试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。

1.1.3 仪器 DYCP-31DN电泳仪（北京市六一仪器厂）;SynergyMx多功能酶标仪（美国BioTek公司）;Biospectrum810凝胶成像系统（美国UVP公司）;Mini-PROTEAN转膜槽（美国BIO-RAD公司）;IX73型奥林巴斯荧光显微镜（日本Olympus公司产品）;罗氏Modular P800生化分析仪（上海罗氏公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理方法 将BALB/C小鼠随机分为对照组（A组）、模型组（B组）、葛根素组（C组）和地塞米松组（D组，阳性对照），每組6只。葛根素组小鼠灌胃给予葛根素100 mg/kg，地塞米松组小鼠腹腔注射地塞米松注射液5 mg/kg，对照组和模型组小鼠灌胃给予等容量的生理盐水。给药1 h后，除对照组外，其他3组小鼠均腹腔注射LPS（10 mg/kg）诱导AKI。12 h后处死小鼠，通过眼球取血并采集肾脏组织进行进一步的检测。

1.2.2 肾组织形态学观察及肾功能指标检测 肾组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定72 h后，行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片（3 μm厚）、苏木精-伊红（HE）染色，在400倍光镜下观察肾组织形态学变化。同时检测血清中肾功能指标血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的含量。

1.2.3 血清中TNF-α和IL-6水平的ELISA检测

按试剂盒说明书检测血清TNF-α和IL-6水平，每份标本重复检测3次，取平均值。

1.2.4 肾组织中iNOX和COX2表达的Western blotting检测 称取肾组织50 mg，用缓冲液匀浆，4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液置另一EP管中。按照比例加入5×SDS上样缓冲液（上清液∶5×SDS上样缓冲液=4∶1），95 ℃变性10 min，分装至EP管中。采用BCA法测定蛋白浓度。每孔取30 μg蛋白上样，经100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，转移至硝酸纤维素膜上，浸入封闭液中室温孵育60 min。加入iNOS、COX2及GAPDH一抗稀释液（1∶1 000稀释）4 ℃冰箱过夜，再加入对应的二抗37 ℃孵育1 h，ECL显影。以GAPDH为内参照，用Image J软件进行吸光度值的定量分析。

1.3 统计学处理

应用SPSS 23.0软件进行数据的录入和统计学分析。计量数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素对LPS诱导的AKI的影响

HE染色显示，与对照组相比，模型组小鼠注射 LPS后在肾组织中可观察到肾小球萎缩，肾小管空泡样变、结构破坏，部分肾小管上皮细胞凋亡甚至坏死;与模型组相比，葛根素组和地塞米松组小鼠肾组织中上述病变显著减轻（图1）。

模型组小鼠血清中BUN和Cr的水平较对照组显著升高，而葛根素组和地塞米松组两者水平较模型组明显降低，差异均有统计学意义（F=51.55、102.75，P<0.01）。见表1。

2.2 葛根素对AKI小鼠肾组织中炎症因子和炎症蛋白的影响

模型组小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6的含量较对照组显著增加，葛根素组和地塞米松组小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量较模型组显著降低，差异均具有统计学意义（F=3 338.15、1 226.85，P<0.01）。见表2。

同樣，模型组小鼠肾组织中炎症蛋白iNOS和COX2的表达较对照组显著升高，葛根素组和地塞米松组小鼠肾组织中iNOS和COX2的表达较模型组显著降低，差异均有统计学意义（F=21 682.77、4 497.00，P<0.01）。见图2、表3。

3 讨论

肾脏是人体内重要的排毒器官。近年来，抗生素、免疫抑制剂等药物在临床上的广泛使用大大增加了肾脏的负担[12]。此外，脓毒血症、造影检查以及介入术应用的普及，也对肾脏造成了不同程度的损伤[13]。相关研究表明，肾脏损伤与全球排名前两位的致命疾病心血管疾病和肿瘤都在一定程度上有着密切的联系，是其常见的并发症[14-16]。高糖血症、高脂血症及抗肿瘤化疗药物都对肾脏有很大的刺激作用[17]。因此，寻找能够减轻AKI的药物具有很重要的意义。

近年来，针对AKI与炎症反应的关系开展了大量的研究[18-19]。总体而言，直接或者间接控制炎症反应强度可以显著减轻AKI。本实验选用炎症刺激剂LPS诱导小鼠建立AKI模型，以寻找有效的抗炎药物来改善AKI。

葛根素是从传统中药葛根中分离的一种异黄酮类活性成分。大量研究表明，葛根素具有抗氧化、舒张平滑肌、改善微循环等作用[20]。葛根素临床上用于治疗心脑血管疾病特别是心绞痛、心肌梗死有很好的疗效[21]。此外葛根素还具有抗肿瘤作用，能够明显抑制肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌细胞的生长并诱导其凋亡[22-23]。基于心血管疾病与肾损伤的密切联系，我们猜测葛根素对肾损伤也有很好的改善作用。在本研究中，模型组AKI小鼠的肾脏表现为肾小球萎缩，肾小管结构破坏及局灶性坏死中心的出现，葛根素预处理显著减轻了肾小球和肾小管损伤，这提示葛根素具有改善肾损伤的作用。有研究表明，葛根素有很好的抗炎作用且能够通过抗炎来改善心血管方面的疾病[5]。本文的研究结果也显示，葛根素预处理使AKI小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6的水平显著降低，同时使肾组织中炎症蛋白iNOS和COX2的表达也明显下降。上述研究提示，葛根素可能通过抗炎症机制减轻LPS诱导的AKI。

随着现代药理学研究的发展，葛根素的临床疗效已经得到越来越多的认可，其药理作用也受到越来越多研究者的重视，但相对于心血管研究领域，葛根素在肾损伤方面的相关研究不是很多，因此开展葛根素治疗肾损伤疾病方面的应用研究具有重要的实用价值。

[参考文献]

[1]YI T Q， HUANG J， CHEN X W， et al. Synthesis， characte-

rization， and formulation of poly-puerarin as a biodegradable and biosafe drug delivery platform for anti-cancer therapy[J]. Biomaterials Science， 2019，7（5）：2152-2164.

[2]ZHANG X L， CAO X Y， LAI R C， et al. Puerarin relieves paclitaxel-induced neuropathic pain： the role of Na v1.8 β1 su-

bunit of sensory neurons[J]. Frontiers in Pharmacology， 2018，9：1510.

[3]SHI W L， YUAN R， CHEN X， et al. Puerarin reduces blood pressure in spontaneously hypertensive rats by targeting eNOS[J]. The American Journal of Chinese Medicine， 2019，47（1）：19-38.

[4]ZHANG S L， CHEN L， ZHOU Z Y， et al. Effects of puerarin on clinical parameters， vascular endothelial function， and inflammatory factors in patients with coronary artery disease[J]. Medical Science Monitor， 2019，25：402-408.

[5]GAO S， LI L Y， LI L， et al. Effects of the combination of tanshinone IIA and puerarin on cardiac function and inflammatory response in myocardial ischemia mice[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2019，137：59-70.

[6]BELLOMO R， KELLUM J A， RONCO C. Acute kidney injury[J]. Lancet， 2019，394（10212）：1949-1964.

[7]POSTON J T， KOYNER J L. Sepsis associated acute kidney injury[J]. BMJ， 2019，364：k4891.

[8]LI X L， CAI W J， LEE K， et al. Puerarin attenuates diabetic kidney injury through the suppression of NOX4 expression in podocytes[J]. Scientific Reports， 2017，7（1）：14603.

[9]GONSALEZ S R， CORT S A L， SILVA R C D， et al. Acute kidney injury overview： from basic findings to new prevention and therapy strategies[J]. Pharmacology & Therapeutics， 2019，200：1-12.

[10]PAN T Y， JIA P， CHEN N， et al. Delayed remote ischemic preconditioning ConfersRenoprotection against septic acute kidney injury via exosomal miR-21[J]. Theranostics， 2019，9（2）：405-423.

[11]YOO J Y， CHA D R， KIM B， et al. LPS-induced acute kidney injury is mediated by Nox4-SH3YL1[J]. Cell Reports， 2020，33（3）：108245.

[12]MOMPER J D， YANG J， GOCKENBACH M， et al. Dyna-

mics of organic anion transporter-mediated tubular secretion during postnatal human kidney development and maturation[J]. Clinical Journal of the American Society of Nephrology： CJASN， 2019，14（4）：540-548.

[13]FU J， CHANG L. Fabrication of fasudil hydrochloride modified graphene oxide biocomposites and its defensive effect acute renal injury in septicopyemia rats[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B， Biology， 2018，186：125-130.

[14]CHEN J， BUNDY J D， HAMM L L， et al. Inflammation and apparent treatment-resistant hypertension in patients with chronic kidney disease[J]. Hypertension， 2019，73（4）：785-793.

[15]ZHAO Y， WANG C， HONG X， et al. Wnt/β-catenin signaling mediates both heart and kidney injury in type 2 cardiorenal syndrome[J]. Kidney International， 2019，95（4）：815-829.

[16]ZHANG J， LUO X， WU Y P， et al. Rod in tube： a novel na-

noplatform for highly effective chemo-photothermal combination therapy toward breast cancer[J]. ACS Applied Materials & Interfaces， 2019，11（4）：3690-3703.

[17]SHEN H， SCIALIS R J， LEHMAN-MCKEEMAN L. Xenobiotic transporters in the kidney： function and role in toxicity[J]. Seminars in Nephrology， 2019，39（2）：159-175.

[18]MEISSNER M， VIEHMANN S F， KURTS C. DAMPening sterile inflammation of the kidney[J]. Kidney International， 2019，95（3）：489-491.

[19]FU H Y， ZHOU D， ZHU H L， et al. Matrix metalloprotei-

nase-7 protects against acute kidney injury by priming renal tubules for survival and regeneration[J]. Kidney International， 2019，95（5）：1167-1180.

[20]LING C， LIANG J， ZHANG C， et al. Synergistic effects of salvianolic acid B and puerarin on cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Molecules， 2018，23（3）：564.

[21]WU L， QIAO H， LI Y， et al. Protective roles of puerarin and Danshensu on acute ischemic myocardial injury in rats[J]. Phytomedicine， 2007，14（10）：652-658.

[22]LIU X Y， LI S G， LI Y Y， et al. Puerarin inhibits proliferation and induces apoptosis by upregulation of miR-16 in bladder cancer cell line T24[J]. Oncology Research， 2018，26（8）：1227-1234.

[23]LIU X X， ZHAO W， WANG W， et al. Puerarin suppresses LPS-induced breast cancer cell migration， invasion and adhesion by blockage NF-κB and Erk pathway[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2017，92：429-436.

（本文編辑 马伟平）