姚伟超 薛莉 刘玉梅 石万达 谢安木

[摘要] 目的 探討干扰长链非编码RNA（LncRNA）NEAT1表达对1-甲基-4苯基-吡啶离子（MPP+）诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B型受体（TrkB）表达的影响。

方法 通过MPP+诱导SH-SY5Y建立帕金森病（PD）细胞模型，慢病毒干扰LncRNA NEAT1调节BDNF及其受体TrkB的表达。实验共分为6组，包括Control组、MPP+组、LncRNA NEAT1-NC组、LncRNA NEAT1-NC+MPP+组、shRNA-LncRNA NEAT1组和shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+组。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法分别检测各组BDNF和TrkB mRNA相对表达水平。

结果 与Control组相比较，MPP+组LncRNA相对表达水平明显升高（t=12.25，P<0.001），MPP+组和LncRNA NEAT1-NC+MPP+组BDNF和TrkB mRNA的相对表达水平明显降低（F=84.36、86.27，q=15.49～16.63，P<0.001）;与MPP+组和LncRNA NEAT1-NC+MPP+组比较，shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+组BDNF和TrkB mRNA的相对表达水平明显增加（F=35.15、12.75，q=5.58～10.49，P<0.01）。

结论 干扰LncRNA NEAT1表达可以抑制MPP+诱导的SH-SY5Y PD细胞模型中BDNF及其受体TrkB的降低，有效遏制MPP+对的SH-SY5Y细胞的毒性作用，起到一定的神经保护作用。

[关键词] 帕金森病;RNA，长链非编码;1-甲基-4-苯基吡啶;脑源性神经营养因子;受体，trkB

[中图分类号] R742.5;R741.02

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0807-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.147

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210707.0949.001.html;2021-07-07 11：53：07

EFFECT OF LONG NON-CODING RNA NEAT1 ON THE EXPRESSION OF BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR AND TYROSINE KINASE RECEPTOR B IN SH-SY5Y CELLS INDUCED BY 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM

YAO Weichao， XUE Li， LIU Yumei， SHI Wanda， XIE Anmu

＼（Department of Neurology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of interference with the expression of long non-coding RNA （LncRNA） NEAT1 on the expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） and its receptor tyrosine kinase receptor B （TrkB） in human neuroblastoma SH-SY5Y cells induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）.

Methods SH-SY5Y cells were induced by MPP+ to establish a cell model of Parkinson’s disease （PD）， and LncRNA NEAT1 was interfered with lentivirus to regulate the expression of BDNF and its receptor TrkB. The cells were divided into control group， MPP+ group， LncRNA NEAT1-NC group， LncRNA NEAT1-NC+MPP+ group， shRNA-LncRNA NEAT1 group， and shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+ group. Quantitative real-time PCR was used to measure the relative mRNA expression levels of BDNF and its receptor TrkB.

Results

Compared with the control group， the MPP+ group had a significant increase in the relative expression of LncRNA （t=12.25，P<0.001）， and the MPP+ group and the LncRNA NEAT1-NC+MPP+ group had significant reductions in the relative mRNA expression levels of BDNF and TrkB （F=84.36，86.27;q=15.49-16.63;P<0.001）. Compared with the MPP+ group and the LncRNA NEAT1-NC+MPP+ group， the shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+ group had significant increases in the relative expression levels of BDNF and its receptor TrkB （F=35.15，12.75;q=5.58-10.49;P<0.01）.

Conclusion Interference with the expression of LncRNA NEAT1 can inhibit the reductions in BDNF and its receptor TrkB in an MPP+-induced SH-SY5Y PD cell model and effectively suppress the toxic effect of MPP+ on SH-SY5Y， thus exerting a certain neuroprotective effect. SH-SY5Y， and play a certain neuroprotective effect.

[KEY WORDS]Parkinson disease; RNA， long noncoding; 1-methyl-4-phenylpyridinium; brain-derived neurotrophic factor; receptor， trkB

帕金森病（PD）是一种以运动迟缓和静止性震颤等为主要特征的神经退行性疾病[1]。中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性、坏死、缺失以及路易小体形成是其主要的病理改变[2]。PD具体的发病机制不清，可能与多种因素相关。在年龄老化及α-突触核蛋白沉积等PD相关的发病机制研究中证明，脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B型受体（TrkB）的表达降低[3-4]。另有研究表明，BDNF-TrkB信号通路在PD的神经保护中发挥重要的作用，可能对PD具有治疗潜力[5-6]。长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度大于200 nt的非编码RNA，可以通过多种不同机制调控基因的表达[7]。已有研究显示，LncRNA NEAT1与PD的炎症、自噬和凋亡等发病机制均有密切的联系[8]。然而，迄今为止有关LncRNA NEAT1在PD神经保护方面的研究很少。故本实验采用1-甲基-4苯基-吡啶离子（MPP+）来诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y构建PD细胞模型，进一步干扰LncRNA NEAT1的表达水平，通过对BDNF和TrkB表达水平的检测，来探讨LncRNA NEAT1在SH-SY5Y PD细胞模型中神经保护方面的潜在作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

胎牛血清由Gibco公司提供;MPP+、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma-Aldrich公司;DEME培养基购自美国Hyclone公司;SH-SY5Y细胞由中国科学院上海细胞库提供;慢病毒购自上海汉恒生物科技有限公司;青霉素/链霉素溶液购自索莱宝公司;RNAiso Plus、PCR逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 细胞培养

用适量DMEM培养液（含有体积分数0.10胎牛血清、100 mg/L链霉素和100 kU/L青霉素）将SH-SY5Y细胞传代后转移至25 cm2的细胞培养瓶中，放置在37 ℃、含体积分数0.05 CO 2的细胞培养箱中培养。

1.3 分组及干预

将接种于6孔板中的SH-SY5Y细胞分为Control组（A组）、MPP+组（B组）、LncRNA NEAT1-NC（C组）、LncRNA NEAT1-NC+MPP+组（D组）、shRNA-LncRNA NEAT1（E组）和shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+组（F组）。待6孔板中的细胞汇合率介于30%～50%时，按照慢病毒说明书配制病毒转染液进行细胞病毒转染。吸去6孔板中旧的培养液，A、B组分别加入2 mL新鲜基础培养液，C、D组分别加入空载病毒感染复数（MOI）为40的基础培养液2 mL，E、F组则分别加入目的病毒MOI为40的基础培养液2 mL。培养24 h后，吸除旧培养液，更换新鲜的完全培养液，继续培养。待感染率达到80%左右时，进行下一步处理。吸除旧培养液，A、C、E组均加入2 mL新鲜基础培养液，B、D、F组均加入含有1 mol/L MPP+的新鲜基础培养液2 mL，37 ℃下继续培养，24 h后收样。

1.4 实时荧光定量PCR（PT-PCR）检测BDNF和TrkB mRNA表达

采用TRIzol法提取细胞的总RNA，每孔加入1 mL的TRIzol进行总RNA纯化提取。取1 μg纯化的总RNA，使用反轉录试剂盒进行反转录。取gDNA Clean Reagent 1 μL、5×gDNA Clean Buffer 2 μL，加RNA和RNase free water使总体积达到10 μL，42 ℃变性2 min。后续加入Evo M-MLVRTase Enzyme Mix 1 μL、RT Master Mix 1 μL、5×RTase Reaction Buffer Mix 4 μL、RNase free water 4 μL，37 ℃反应15 min，85 ℃反应15 s，逆转录完成得到cDNA。采用两步法PCR反应程序检测BDNF和TrkB mRNA的相对表达。RT-PCR扩增引物及其序列见表1。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。实验重复5次，取平均值。

1.5 统计学分析

使用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析。所得实验数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，继以Turkey法进行组间两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPP+处理对SH-SY5Y细胞LncRNA表达的影响

Control组和MPP+组LncRNA NEAT1的相对表达量分别为1.04±0.10和2.10±0.16，两组比较差异具有统计学意义（t=12.25，P<0.001）。表明MPP+处理可以上调SH-SY5Y细胞中LncRNA NEAT1的表达，提示PD中LncRNA NEAT1的表达增加。

2.2 干扰LncRNA NEAT1对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞BDNF和TrkB mRNA表达影响

与Control组细胞相比，MPP+组和LncRNA NEAT1-NC+MPP+组BDNF和TrkB mRNA的相对表达水平明显降低（F=84.36、86.27，q=15.49～16.63，P<0.001）;与MPP+组和LncRNA NEAT1-NC+MPP+组细胞比较，shRNA-LncRNA NEAT1+MPP+组BDNF和TrkB mRNA的相对表达水平明显增加（F=35.15、12.75，q=5.58～10.49，P<0.01）。表明MPP+處理可以下调SH-SY5Y细胞中BDNF和TrkB mRNA的表达;干扰LncRNA NEAT1的表达，可以在一定程度上遏制MPP+对SH-SY5Y细胞的毒性作用，起到一定的神经保护作用。见表2。

3 讨论

PD是一类发展缓慢、进行性的神经退行性疾病。目前全世界大约有600多万人患有PD[9]。PD的治疗涉及药物学方法和非药物学方法。随着科学研究的不断进步发展，神经营养因子在神经保护和神经再生方面的作用日益突出。

BDNF最初是由BARDE等[10]在猪脑中提取纯化的，并且被证明可以促进感觉神经元的生长。BDNF在成人中枢神经系统（包括皮质区域、海马区、视皮质以及黑质等多个部位）分布广泛，尤其是在多巴胺能神经元中含量丰富。BDNF主要在中枢神经系统合成，是体内含量最多的神经营养因子，它通过与TrkB结合发挥作用[11]。在星形胶质细胞中，BDNF可以通过激活Nrf2保护多巴胺能神经元免受铁蛋白损伤[3]。本研究结果显示，MPP+诱导的SH-SY5Y PD细胞模型中BDNF的表达水平降低。有研究表明，在PD动物模型中，BDNF可以提高多巴胺能神经元的存活率，改善多巴胺能神经传递和运动性能[6]。TrkB是大脑中分布最广泛的神经营养受体之一，高度富含于新皮质、海马、纹状体和脑干[12]。在神经系统中，TrkB常与BDNF结合，在突触传递和突触重塑等多个方面发挥作用[13-14]。BDNF-TrkB还可以通过激活PI3K/AKT/CREB和Ras/MAPK/Erk信号轴调节神经元的分化和生长[15]。大量证据表明，BDNF和TrkB在黑质多巴胺能神经元中高度表达和激活[16]。在一项加强体育锻炼预防PD抑郁症状的研究中发现，BDNF和TrkB的表达水平上升，体育锻炼主要通过诱导转录因子和与神经元增殖、存活及炎症反应相关的基因表达来抑制神经变性，进而影响BDNF及TrkB表达，发挥神经保护和神经再生的作用[17]。另外有研究发现，在6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠模型中，纹状体内植入基因改造的成纤维细胞，其产生的BDNF可以保护多巴胺能神经元[18]。上述研究说明BDNF/TrkB信号传导在PD的神经保护方面有重要作用，有治疗和预防PD的潜力。

近年来多项研究结果表明，LncRNA在中枢神经系统中大量表达，并且在中枢神经的发生发展中起重要作用[19]。KRAUS等[20]通过对PD病人的lncRNA表达谱研究发现，lncRNA-p21、MALAT1、SNHG1、NEAT1和H19的表达存在显著差异。一项干扰LncRNA NEAT1促进贝沙罗汀治疗创伤性脑损伤小鼠的研究表明，低表达LncRNA NEAT1能在一定程度上抵抗神经损伤作用[21]。本研究结果显示，MPP+诱导SH-SY5Y的PD细胞模型中LncRNA NEAT1的表达水平升高。有研究发现，LncRNA LINC00641协同miR-497-5p可通过上调BDNF来改善麻醉诱导的神经损伤[22]。另外，一项探讨维生素B1和B12对脑瘫神经元损伤的保护作用的研究表明，LncRNA MALAT1可以在一定程度上调节BDNF的表达水平，从而抑制脑瘫大鼠神经元细胞凋亡和减轻神经损伤[23]。据此推测，干扰LncRNA NEAT1的表达，可能会增强BDNF及其受体TrkB的表达，抑制多巴胺能神经元的损伤，发挥一定的神经保护作用。本实验采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）的毒性代谢产物MPP+诱导SH-SY5Y建立PD细胞模型[24]。结果显示，MPP+作用于SH-SY5Y细胞时，LncRNANEAT1表达水平明显升高。进一步干扰LncRNA NEAT1表达的RT-PCR检测结果显示，BDNF和TrkB mRNA的相对表达水平升高，提示干扰SH-SY5Y的PD细胞模型LncRNA NEAT1的表达可以抑制BDNF和TrkB的降低，在一定程度上抑制神经细胞受损，起到了神经保护作用。

综上所述，本研究初步证明了干扰LncRNA NEAT1的表达能够抑制MPP+诱导的SH-SY5Y PD细胞模型的神经损伤，增加神经营养因子BDNF及其受体TrkB的表达水平，发挥一定的神经保护作用。本研究关于LncRNA在PD神经保护方面的新探索，为PD的预防和治疗提供了新的思路。

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（本文编辑 马伟平）