兰洁 田维兵 徐龙芳 徐慧 刘世国 王芳

[摘要] 目的 探討山东地区先天性甲状腺功能低下症（CH）伴甲状腺发育不良（TD）病儿HOXA5基因突变的特征及其基因型-表现型的关系。

方法 收集山东地区266例CH伴TD病儿血液标本，从外周血白细胞中提取全基因组DNA，聚合酶链反应扩增HOXA5基因的外显子区及外显子与内含子交界处100 bp的区域，扩增产物用Sanger测序，并进行生物信息学分析。

结果 266例病儿中发现2例（0.75%）病儿分别携带HOXA5 c.34C>G（p.R12G）和c.337G>A（p.D113N）新的错义杂合突变，而在200例同种族的正常人中没有检测到这些突变位点。生物信息学预测和美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南分析发现，突变c.34C>G（p.R12G）和c.337G>A（p.D113N）都可能致病。

结论 在山东地区CH伴TD病儿中发现2个新的HOXA5基因突变，表明HOXA5基因突变与CH的发病有关，HOXA5基因可能是CH伴TD的候选致病基因，然而基因型与表现型之间的关系尚不明确。

[关键词] 先天性甲状腺功能减退症;甲状腺发育不全;基因，同源盒;突变;山东

[中图分类号] R581.21;R581.9

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0796-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.146

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210706.1546.001.html;2021-07-07 09：00：45

DETECTION AND PATHOGENICITY ANALYSIS OF HOXA5 GENE MUTATION IN CHILDREN WITH CONGENITAL HYPOTHYROIDISM AND THYROID DYSGENESIS IN SHANDONG， CHINA

LAN Jie， TIAN Weibing， XU Longfang， XU Hui， LIU Shiguo， WANG Fang

（Department of Endocrinology and Metabolism， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the features of HOXA5 gene mutation and its genotype-phenotype relationship in children with congenital hypothyroidism （CH） and thyroid dysgenesis （TD） in Shandong， China.

Methods Blood samples were collected from 266 children with CH and TD in Shandong， and whole genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes. Polymerase chain reaction was used to amplify the exon region of the HOXA5 gene and the 100 bp region at the junction of the exon and the intron， and Sanger sequencing was performed for the amplified products. A bioinformatics analysis was also performed.

Results Among these 266 children， 2 （0.75%） were found to have novel missense heterozygotes mutations of the HOXA5 gene， i.e.， c.34C>G（p.R12G） and c.337G>A（p.D113N）， while these mutations were not detected in 200 normal individuals of the same ethnicity. Bioinformatics prediction and ACMG guideline analysis showed that both c.34C>G（p.R12G） and c.337G>A（p.D113N） mutations might be pathogenic.

Conclusion Two novel HOXA5 gene mutations are found in children with CH and TD in Shandong， suggesting that HOXA5 gene mutation is associated with the development of CH and the HOXA5 gene may be a candidate pathogenic gene for CH with TD. However， the genotype-phenotype relationship remains unclear and needs further study.

[KEY WORDS]congenital hypothyroidism; thyroid dysgenesis; genes， homeobox; mutation; Shandong

先天性甲状腺功能低下症（CH）是最常见的新生儿内分泌疾病之一，由于胚胎期某些病因的作用使甲状腺轴的发生、发育和功能出现异常，导致血循环中甲状腺激素水平减低，引起病儿生长发育迟滞、智力发育障碍和生理功能低下等，俗称呆小症。全球范围内新生儿CH发病率为1/（1 400～2 800），男女之比为1∶2[1-2]。虽然遗传因素被证明与不到10%的CH有关[3]，但在此基础上，CH可分为甲状腺发育不全（TD）和甲状腺激素合成障碍两类，TD约占CH病人的85%，是甲状腺形成过程异常导致的缺如、异位和发育不良等[4-5]，其中异位甲状腺最常见，占TD病人的50%～60%，且通常位于舌下位置[5]。另外15%的CH是由甲状腺激素合成及代谢障碍所引起，与双氧化酶2（DUOX2）、甲状腺球蛋白（TG）和甲状腺过氧化物酶（TPO）等基因突变相关[6]。TD通常被认为是一种散发性疾病，尽管2%的家族性病例支持孟德尔遗传，但不能排除其他遗传方式，如多基因、多因素和表观遗传[7-8]。TD单基因遗传方式可能和参与甲状腺形成的几个基因的突变有关，包括TSHR、NKX2.1、FOXE1以及PAX8 [9-10]。 最近研究又发现几个与TD相关的致病基因：NKX2-5、GLIS3、JAG1、CDCA8、TUBB1、NTN1等[11]。然而，这些所有已知致病基因的病例只占TD病人的5%，大多数TD病例的病因分子机制尚未明确，可能存在未发现的新基因突变。

2003年有国外学者首次在HOXA5-/-小鼠模型中发现，幸存的突变小鼠出现甲状腺功能减退症表现，包括短暂性生长迟缓、延迟眼开放和耳朵抬高等[12]。HOXA5 属于同源盒基因（HOX）家族，位于7p15.2，包含2个外显子，编码由270个氨基酸组成的ANTP类同源结构域蛋白[13]，该蛋白作为一种转录因子可调控基因的表达、细胞分化和机体形态的发生。HOXA5基因在呼吸道、消化道的形态发生，甲状腺和乳房的发育，以及卵巢的动态平衡中起重要作用[14]。MEUNIER等[12]证实，HOXA5基因可能作用于与甲状腺功能和发育调节相关基因Nkx2-1、Pax8和Titf2的表达而影响甲状腺的发育。但是，至今未见关于该基因在CH病人中突变的报道，其致病机制仍不清楚。故本研究对山东地区266例确诊为CH伴TD的病儿进行了HOXA5基因变异筛查，旨在探讨HOXA5基因突变与山东地区CH伴TD病儿的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2010 年6 月—2018 年10月，于山东省各地级市（济南、青岛、济宁、临沂、烟台、枣庄、淄博、潍坊、聊城、泰安和德州）共选取266例CH伴TD病儿为研究对象，其中包括118例（44.4%）甲状腺缺如，81例（30.5%）甲状腺异位，67例（25.2%）甲状腺发育不良。266例病儿中，男性120例，女性146例，男女之比为1∶1.2;平均年龄为（3.5±1.8）岁。纳入标准：①出生后72 h～7 d的新生儿，用滤纸从足跟采血，酶联免疫吸附法测定促甲状腺激素（TSH）水平，TSH≥20 mU/L者召回复查，电化学发光免疫分析法测定游离甲状腺素（FT4）水平低（正常范围为12～22 pmol/L）、血清TSH水平高（正常范围为0.27～4.20 mU/L）者，诊断为CH;②病儿经甲状腺B 超或甲状腺核素扫描确诊为TD;③所有病儿无血缘关系且经过体检已排除CH外的其他先天性疾病。选取新生儿筛查中甲状腺功能正常的200例新生儿作为对照组。本研究获得了青岛大学附属医院医学伦理委员会批准（2018-036），且已告知病儿及对照新生儿家属并获取知情同意。

1.2 基因提取

使用血凝块DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），根据说明书操作，从266例病儿和200例对照新生儿的血液样本中提取DNA，用紫外线分光光度计检测其浓度与纯度，需在OD260处有显著吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7～1.9。基因提取后置-20 ℃保存。

1.3 PCR扩增

①引物设计：使用DNASTAR 7.1软件设计HOXA5基因全编码区（外顯子区及外显子与内含子交界处100 bp的区域）引物，由美国赛默飞世尔公司合成。引物序列和扩增长度见表1。②反应体系为：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，双蒸水7 μL，2×Master Mix（北京擎科新业生物技术有限公司）10 μL，DNA模板2 μL（50～100 μg/L），共20 μL。③反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃再延伸5～10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR产物测序

将5 μL PCR产物原液和1 μL 6×DNA上样缓冲液加入到10 g/L琼脂糖凝胶孔中，在1×TAE电泳液中，130 V电泳25 min，采用Bio-Rad GelDoc XR+凝胶成像系统进行结果分析。如果目的条带单一且清晰明亮，则使用ABI 3730XL自动测序仪进行PCR产物纯化及Sanger测序。

1.5 测序结果的生物信息学分析

应用BioEdit V7.0.1分析测序结果并与NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中HOXA5基因序列（NM_019102.4）进行比对，从中找出可能存在的基因突变位点。对检测到的突变体进行蛋白保守性分析，比较多个物种之间的同源性，最后通过 PROVEAN、SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）， Polyphen-2 （http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）， MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org/）预测所发现突变的有害性，并依据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）的评估指南[15]，对基因突变进行致病性分析。

2 结果

2.1 HOXA5 基因检测

在266例CH伴TD病儿中分别检测到1例HOXA5基因c.34C>G（p.R12G）突变（图1A）和1例HOXA5基因c.337G>A（p.D113N）突变（图1B），均为错义杂合突变。2例病儿携带的突变均位于HOXA5基因第1号外显子，其中c.34C>G的第34位碱基由C变为G，导致第12位密码子的精氨酸变为甘氨酸（p.R12G），c.337G>A的第337位碱基由G变成A，使得第113位密码子的天冬氨酸变成天冬酰胺（p.D113N）。在200例正常对照新生儿中均未检测到这两个变异（图1）。

2.2 突变生物信息学分析

用DNAMAN软件对不同物种的蛋白序列进行比对显示，p.R12G、p.D113N两个突变均位于HOXA5基因保守区域（图2）。用多种生物信息学软件（PROVEAN、SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster）预测突变的蛋白危害性，依据ACMG遗传变异分类标准和指南，本研究中检测到的HOXA5基因的两个突变c.34C>G/p.R12G （PS4、PM2、PM6、PP3）和c.337G>A/p.D113N（PS4、PM2、PM6）都被判定为“可能致病”。见表2。

2.3 基因型与表现型的关系

病儿1（HOXA5基因c.34C>G/p.R12G）为男性病儿，妊娠39周时经剖宫产分娩，出生体质量3 400 g，出生身高49 cm，Apgar评分10分。新生儿筛查示足跟血TSH 112.5 mU/L，出生后14 d被召回复查甲状腺功能，结果示TSH 168.1 mU/L、FT4 5.8 pmol/L、FT3 4.5 pmol/L，诊断为CH。该病儿父母甲状腺B超检查均正常，无CH家族史。治疗前行甲状腺99mTc扫描示甲状腺缺如。病儿表现为轻微的嗜睡和较严重的黄疸，服用左旋甲状腺素（优甲乐）治疗至今，初始剂量为25 μg/d，5年后现用药剂量为75 μg/d。病儿2（HOXA5 c.337G>A/p.D113N） 为女性病儿，母亲有孕期一过性甲状腺功能异常史，妊娠40周时经阴道分娩，出生体质量3 650 g，出生身高48 cm，Apgar评分10分。新生儿筛查示足跟血TSH 66.7 mU/L，出生12 d时被召回复查甲状腺功能，结果示TSH 135 mU/L，FT4 4.2 pmol/L，FT3 3.8 pmol/L。甲状腺99mTc扫描示甲状腺发育不良，甲状腺未分叶，呈球形，大小约为3.1 cm×2.0 cm。初始服用优甲乐剂量为25 μg/d，7年后现用药剂量为50 μg/d。现2例病儿生长发育和智力都正常。

3 讨论

甲状腺的形态发育起源于原始咽部内皮细胞和神经嵴细胞这两种不同的前体，前者形成甲状腺滤泡细胞（TFC），后者在发育早期迁移至双侧多鳃肌体，生成滤泡旁C细胞[11]。TFC是腺体中数量占95%的细胞群，形成甲状腺滤泡，其球形结构用于储存和控制甲状腺激素的释放[16-17]。在原始咽部的内皮细胞中，甲状腺原基的发育分别发生在小鼠和人胚胎发育的8.0～8.5 d和20.0～22.0 d，分别在13.5 d和45.0～50.0 d完成向下迁移[18]。从小鼠胚胎发育8.5 d开始，TFC已经获得明显的分子特征，即共表达4种转录因子（HHEX、Nkx2.1、Pax8和Foxe1）[19]，这表明它们是甲状腺早期阶段形态发生所必需的。甲狀腺形态发生异常或甲状腺发育不全通常是由于调节甲状腺发育的基因发生突变，然而仅有小部分是由NKX2.1、FOXE1、PAX8、HHEX和TSHR等这些已知的基因缺陷造成的，大多数TD病例的病因分子机制目前尚不清楚。本文纳入266例确诊CH伴TD病儿，对可能和甲状腺发育相关的基因HOXA5进行全编码区PCR扩增及Sanger测序筛查突变，发现了2例（0.75%）病儿均携带一个可能致病的突变基因。

HOX是一个高度保守的基因家族，在控制体节特异性结构的形成中占据中心地位[20]。因此，HOX基因的突变会改变节段的同一性并导致形态缺陷[21]。在哺乳动物中，HOX家族包含4个HOX簇（A、B、C和D）中的39个基因，这39个基因又可进一步细分为13个平行对数组（PG1～PG13）[22]，HOXA5是A簇、PG5的一个成员。人类HOXA5基因编码分子量29 000大小、包含270个氨基酸的蛋白，该蛋白是调节细胞生长、分化和凋亡的转录调控因子[23]。目前对于HOXA5的研究主要集中于其在多种癌症中的异常表达，研究表明其可能与癌细胞的增殖、迁移和凋亡过程有关[24]，而其与甲状腺疾病关系的相关研究较少。MEUNIER等[12]对hoxa5-/-突变小鼠的表型调查结果表明，幸存的突变小鼠表现出一过性生长迟缓、睁眼和耳朵抬起延迟等甲状腺功能减退的症状;hoxa5-/-小鼠与野生型杂合子小鼠相比较，T4水平差异无显著性，但在15日龄时，hoxa5-/-小鼠TSH水平比野生型高43%，2 d后二者水平一致;此外，进一步的研究表明，HOXA5基因功能丧失导致甲状腺功能和发育的基本调节因子的表达水平发生了短暂的变化[12]。这与HOXA5基因敲除后在呼吸道形态发生过程中观察到的结果有相似之处，即突变体中多个基因表达水平的微小变化可能是由于HOXA5功能缺乏而导致的整体变化[25]。然而，在CH的人群中，到目前为止未有HOXA5基因突变的报道。本研究发现2例病儿分别携带HOXA5 c.34C>G/p.R12G和c.337G>A/p.D113N杂合突变，且这两个变异为国内外首次报道。其中突变c.34C>G/p.R12G使HOXA5第12位的精氨酸变为甘氨酸，而c.337G>A/p.D113N导致第113位的天冬氨酸变为天冬酰胺。进一步生物信息学分析表明，两个突变都位于HOXA5蛋白相对保守区，而且多种致病性预测软件和ACMG评级的结果均显示，c.34C>G/p.R12G、c.337G>A/p.D113N均为“可能致病”变异。本研究首次发现HOXA5基因突变与人类CH的发病有关，并且认为HOXA5可能是CH伴TD的候选致病基因。此外，本研究发现2例携带HOXA5基因突变的病儿均有明显的甲状腺结构和功能异常，在新生儿筛查时期也均检测到高水平的TSH。甲状腺超声检查示1例病儿甲状腺缺如，另1例病儿甲状腺发育不良。然而，基因型和表现型的关系还可能受其他多种因素的影响，仍需要进一步扩大样本进行研究。

上述HOXA5基因突變引起CH的机制尚不清楚，HOXA5的表达仅限于毗邻甲状腺的间质，提示该基因对甲状腺发育和功能的作用必须由信号分子介导[12]。HOXA5在肺、胃和肠形态发生过程中控制间充质-上皮串扰的报道[26]进一步支持了这一假说。关于这种非细胞自主方式如何影响甲状腺的形成还有待进一步研究。此外，由于本研究中山东地区HOXA5基因变异率较低，仅为0.75%，我们正在全国范围内扩大样本量，将通过新一代高通量测序进一步筛选HOXA5基因变异，并通过后续的体内外实验验证HOXA5基因变异的致病性。

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（本文編辑 马伟平）