李佩仪 张新春

中山大学附属口腔医院 中山大学光华口腔医学院 广东省口腔医学重点实验室 广州510055

颌骨是整个颜面部外形的支撑结构，也是咀 嚼器官、语言器官、呼吸器官的重要组成部分，继发于外伤、肿瘤、炎症等常见疾病的口腔颌面部骨缺损从生理、心理两方面给患者造成严重影响。目前颌面骨再生仍以传统的自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植为主，这些方法具有供体受限、受体排斥、疾病传播等弊端，社会医疗成本较高，寻找合适的颌面骨替代品一直是口腔骨修复研究的重要方向[1‑2]。

组织工程骨因其来源广泛、制作方便、无免疫原性等优点，已逐渐成为临床骨缺损修复的研究热点[3]。组织工程骨植入体内后，细胞及其代谢产物、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）、生长因子及机体对材料的反应产物构成了成骨微环境，是调动机体自身修复能力和生物材料再生功能的关键。成骨微环境的酸碱度参与免疫调控、血管再生和新骨形成，尤与骨骼系统直接相关，影响骨再生细胞功能及矿物盐沉积，其水平与机体损伤和植入材料的降解产物有关，本文综述成骨微环境酸碱度在组织工程骨再生中的研究进展，为颌面人工骨材料研发与转化提供参考。

1 微环境酸碱度与组织工程骨再生

酸是细胞能量代谢的副产物，葡萄糖分子既可通过无氧代谢生成乳酸，也可通过有氧代谢转化为乙酰辅酶A 和二氧化碳，二氧化碳在体液中形成的碳酸和碳酸氢盐是机体pH 缓冲系统的重要组成部分[4]。健康的机体可通过呼吸、肾脏排泄和骨骼缓冲等过程，调节二氧化碳、碳酸氢盐和H+间平衡以稳定pH[5]。肾病、呼吸系统疾病、糖尿病等疾病将导致系统性酸中毒或碱中毒，而肿瘤、创伤、感染和炎症等病理状态将干扰局部pH 缓冲系统，造成微环境酸碱失衡。骨组织羟磷灰石可根据体液酸碱度溶出或沉积以缓冲pH 变化[6‑7]。此外，骨相关细胞对pH变化敏感，胞外H+在激活破骨细胞骨吸收的同时，抑制成骨细胞分泌骨基质、减少矿物盐沉积[8‑11]；碱性环境则刺激成骨细胞功能、抑制破骨活性，促进骨形成[12‑13]。

颌面骨缺损由于血供减少、无氧代谢增加，血肿、感染、炎症等反应聚积乳酸，形成局部酸性微环境。Hazehara‑Kunitomo等[14]测量小鼠拔牙窝内pH，在最初2 d，pH 由7.4 降至6.8，7 d 后恢复至7.0左右。而组织工程骨因血管长入受限、炎症反应及人工骨内细胞所处空间有限等因素，周围体液缓冲效果较弱，易积聚酸性代谢产物，使细胞对pH 变化的敏感性上升[13,15]。微环境pH 是组织工程骨再生中重要的物理因素，影响人工骨表面蛋白吸附、成骨相关细胞迁移、黏附、增殖、分化、骨基质分泌成熟、生物矿化，以及骨缺损区炎症反应和血管重建等骨再生过程，了解微环境pH 在组织工程骨再生中的作用可为颌面骨材料研发和临床骨修复治疗提供参考[9‑11,16]。

1.1 组织工程骨表面蛋白吸附

来源于血液、细胞外液的蛋白吸附至植入材料表面是组织工程骨再生的第一阶段，直接影响材料的细胞相容性[17]。骨植入材料表面蛋白可与胞膜整合素结合，为细胞黏附提供识别位点；同时控制晶体成核和生长，是生物矿化的关键[18‑19]。

蛋白质在材料表面的吸附涉及范德华力，疏水作用力、静电力及氢键作用，影响因素包括蛋白种类、构象、材料表面化学、粗糙度、溶液pH值等，而溶液pH 值是改变蛋白电负性和构象的关键因素[17‑18]。蛋白质是具有酸性和碱性官能团的生物两亲性分子，总电荷与外界pH 值和蛋白等电点（isoelectric point，pI）有关。Yadav 等[20]调节溶液pH 使溶菌酶带正电荷，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）带负电荷，带正电的溶菌酶可强力吸附于二氧化硅纳米粒子的负电表面，吸附量随溶菌酶浓度上升而上升，吸附最大值随溶液pH接近溶菌酶等电点（pI为11.1[21]）而增加。相反，带负电的BSA 无吸附现象。除蛋白‑材料间的静电作用力以外，pH 还通过改变蛋白构象影响二者间相互作用，这种构象转变可能与蛋白内部电荷分布不均有关[22]。Kumar等[23]观察二氧化硅纳米粒子和溶菌酶的吸附行为，随溶液pH 下降（pH 9.0/7.0/5.0），溶菌酶构象改变，纳米颗粒表面蛋白吸附系数升高但蛋白吸附总量下降。Raoufi等[24]进一步利用荧光共振能量转移方法，监测纤连蛋白在金纳米颗粒上的构象变化，发现酸性pH 解折叠纤连蛋白，降低其亲和力，减少吸附。

微环境酸碱度通过静电作用力和蛋白构象初步筛选材料表面蛋白，细胞对不同蛋白、不同构象的黏附位点不尽相同，由此影响细胞黏附并改变整合素相关的信号转导通路，影响骨再生[25]。

1.2 组织工程骨表面细胞迁移、黏附与增殖

骨修复相关细胞在人工骨材料表面的迁移、黏附与增殖是骨质形成和生物矿化的前期基础，决定新骨形成和骨整合效果[26‑27]。

胞外酸性微环境不利于间充质干细胞（mes‑enchymal stem cells，MSCs）的迁移与黏附，但对破骨细胞的迁移黏附有促进作用。酸性预处理（pH6.8）的人骨髓间充质干细胞（human bone mar‑row mesenchymal stem cells，hBMMSCs）迁 移 与黏附能力显著下降[14]。但Ahn等[28]研究认为，胞外酸中毒可刺激破骨细胞合成含有精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸序列的骨桥蛋白，激活Pyk2、Cbl‑b、Src等相关信号通路，促进其迁移黏附。进一步研究在酸性环境下阻断了巨噬细胞酸敏感离子通道1a（activated acid‑sensing ion channel 1a，ASIC1a），发现巨噬细胞及其分化的破骨细胞迁移黏附能力下降，显示酸性环境可能通过ASIC1a/整合素ανβ‑3/Pyk2/Src 促进破骨细胞的迁移黏附[29]。破骨细胞迁移黏附能力的上升还可能与酸性微环境改变胞膜整合素蛋白构象有关[30]。整合素是胞膜上的异二聚体α/β跨膜蛋白，参与包括迁移和黏附在内的多种细胞活动。分子动力学模拟研究显示，酸性pH使整合素构象由平衡态转向高亲和力的延伸‑开放状态，通过开放ανβ3 头部进而活化黏附受体，上调细胞迁移黏附效率[31]。目前尚缺乏碱性环境对骨再生细胞迁移黏附影响的实验报道，然而在大鼠皮肤全层创口的愈合研究中发现：碱性环境可降低人角质形成细胞和皮肤成纤维细胞的迁移活动，亦说明碱性pH 可能对骨缺损区细胞迁移有一定影响[32]。

微环境pH 影响MSCs 与成骨细胞的增殖能力。Hazehara‑Kunitomo等[14]研究发现，酸性预处理（pH6.8）可增强hBMMSCs 表面干细胞标志物表达，提高细胞活力与增殖。Galow等[33]调节小鼠前成骨细胞培养pH 值，发现碱性环境（pH8.0～8.4）对其初期增殖也有显著促进作用。然而Li等[34]在钛表面制备分层微/纳米孔膜，发现碱处理的钛表面局部pH 升高，导致细胞发生碱中毒，显著抑制了BMMSCs 增殖，提示碱性环境对细胞增殖有负面作用。将pH 范围进一步拓宽后发现，酸性（pH6.3/6.7）与极碱（pH8.5）环境通过促进细胞衰老显著抑制hBMMSCs 的增殖能力，而生理（pH7.0/7.4）与弱碱环境（pH8.0）更有利于细胞的生存与增殖[35]。

综上，与过碱环境相比，生理性和弱碱性的微环境pH 对骨再生相关细胞的增殖有一定的促进作用，但酸性环境对细胞增殖的影响仍存在争议。此外，目前关于微环境pH 对成骨相关细胞迁移、黏附的影响尚无定论，需更多研究以阐明其机制。

1.3 MSCs成骨向分化、骨基质分泌与生物矿化

MSCs迁移黏附至骨缺损区，在成骨相关转录因子作用下成骨分化，合成碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原和非胶原蛋白，形成有机骨基质，基质沉积矿化为羟磷灰石形成新骨。有机骨基质在骨组织中占比约达30%，主要来源于成熟成骨细胞，其产量取决于干细胞成骨分化水平与成骨细胞的功能活性，二者均受胞外酸碱环境影响，而与生物矿化相关的骨矿物盐沉积和破骨细胞功能也受微环境pH作用[36]。

胞外pH 影响干细胞成骨向分化与成骨细胞分泌骨基质蛋白。酸性微环境不仅抑制MSCs 成骨向分化，也降低成骨细胞的功能活性。酸性pH 可诱导MSCs 表达干细胞相关基因和蛋白，使其驻留在G0静止期而不分化为终末细胞[37]。Tao等[38]研究发现，胞外H+可能通过GPR4/cAMP/PKA 通路抑制hBMMSCs 成骨分化。在骨基质合成方面，Fliefel等[35]认为酸性pH 降低hBMMSCs 胶原合成，抑制ECM 合成和ALP活性。体外实验显示，胞外pH 由7.5 降至6.6 时，hBMMSCs 的ALP 活 性和 胶原合成数量下降50%至70%[39]。此外，慢性酸中毒还通过下调小鼠成骨细胞基质Gla蛋白和骨桥蛋白基因表达，抑制骨基质合成[40]。与酸性环境不同，碱性环境可刺激MSCs 与成骨细胞的功能活性，利于细胞成骨向分化和基质合成。Kato等[41]发现，弱碱环境可提高成骨细胞的分化水平。Flie‑fel等[35]认为，pH8.0 和8.5 是促进hBMMSCs 增殖和成骨向分化的适宜pH。此外，碱性环境还具有显著的促骨基质合成效果。Bushinsky[42]调整小鼠颅骨培养环境模拟碱中毒状态（pH＞7.5），碱性pH 在降低小鼠颅骨净钙流出量的同时，促进成骨细胞胶原合成。

微环境pH 除了影响细胞成骨向分化和骨基质合成，还在物理化学层面和细胞层面作用于骨基质矿化过程。Brandao‑Burch等[9]研究发现，随pH降低，胞外Ca2+浓度上升，羟磷灰石溶解，这与弱碱性羟磷灰石易溶于酸难溶于碱的特性有关；胞外H+还通过成骨细胞OGR1/Gq/11/磷脂酶C/蛋白激酶C 途径促进环氧合酶‑2（cyclooxygenase‑2，COX‑2）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）生成，小鼠前成骨细胞ALP 活性和钙化结节数量随pH 降低而显著下降[43]。骨基质矿化除了与钙盐的物理化学沉积有关，还受破骨细胞骨吸收影响。破骨细胞活化后的骨吸收作用对骨生物矿化有负面效应，而胞外H+是破骨细胞成熟与活化的关键分子。Okito等[44]发现，酸性环境下小鼠成骨细胞G蛋白偶联受体（G protein‑coupled receptors，GP‑CRs）质子传感器GPR4 活化，激活cAMP/PKA 通路，使成骨细胞分化为破骨细胞支持表型，分泌更多核因子κB 受体活化因子配体（receptor acti‑vator of nuclear factor‑κB ligand，RANKL）。而胞外H+和RANKL 均可上调大鼠破骨细胞内破骨细胞转录因子和活化T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，NFATc1），继而促进RANKL 刺激的NFATc1 核移位，诱导破骨细胞活化[45]。

与酸性环境不同，碱性pH 可促进胞外生物矿化并抑制破骨活化。调节小鼠前成骨细胞培养pH发现细胞外钙沉积具有pH 依赖性，pH7.4 组直到第21天都无法检测到钙盐沉积，而pH7.8组在21d后可见大量细胞外钙[33]。碱处理的钛植体表面在模拟体液中的表面矿化水平也有明显提高[46]。类似的研究[35]发现，微环境pH 由7.4 上升至8.0 时，生物矿化程度轻微上升，8.0 时矿化成核中心稳定且不溶。但pH 进一步上升至8.5 后出现骨矿化不良，这可能与钙镁磷酸盐在碱性环境下溶解有关。在骨吸收方面，碱性环境还可中和H+，干扰前破骨细胞融合形成多核破骨细胞的过程，降低破骨细胞β‑葡萄糖醛酸酶释放，抑制破骨活动，稳定骨矿物盐[11,42]。

1.4 骨缺损区炎症反应与血管再生

骨缺损区局部急性炎症反应常由组织创伤或伤口感染引起，该炎症反应常与破骨细胞激活的骨丧失有关，然而，成骨微环境的炎症改变常常具有两面性[47]。在大鼠牙槽骨缺损修复模型中，早期炎症阶段pH 较低，后期矿物沉积阶段pH 回升，胞外pH 随炎症进程而变化[14]。此外，骨缺损早期由于缺氧导致细胞无氧酵解，产生酸性微环境。胞外酸性环境独立于氧气，对血管再生有不利影响。酸性pH 抑制大鼠成骨细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达。短期内，骨缺损区血管断裂引起的氧水平下降可上调VEGF，但持续的酸负荷下调VEGF表达，不利于血管再生[48]。

理想状态下，骨修复早期的酸性炎性环境可募集骨祖细胞并维持其干性，后期的碱性抗炎微环境则有利于MSCs 的成骨分化、骨矿物盐沉积及血管再生[45,49]。

2 调控成骨微环境酸碱度以促进骨再生修复

与酸性微环境促进骨质吸收相比，碱性微环境则通过刺激成骨细胞、抑制破骨细胞功能促进骨质形成[12‑13]。碱化骨缺损区的酸性微环境是改善组织工程骨再生治疗的可能方案。人工碱化骨再生微环境pH 的方法主要包括控制炎症反应减少酸性物质生成、促血管生成改善细胞无氧酵解以及植入碱性材料中和酸性物质等。

2.1 抑制骨缺损区炎症反应

骨创伤区因感染和组织损伤引起持续性炎症反应，加剧酸化水平。控制感染和局部应用抗炎因子均可调节炎症介质生成，缓解炎症。Chen等[50]在大鼠牙槽骨炎性缺损中植入人颗粒蛋白前体（human progranulin，hPGRN）搭载的胶原蛋白膜支架，发现hPGRN 显著抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF‑α）表达并减少抗酒石 酸酸 性磷 酸酶（tartrate‑resistant acid phospha‑tase，TRAP）染色阳性的破骨细胞数量，说明hPGRN 可抑制缺损区炎症反应和破骨细胞活化。然而炎症反应复杂、炎症介质多样，对靶组织影响不可控，且炎症反应与微环境pH 互为因果，试图通过抗炎调节局部pH 存在一定困难，相关研究仍有待进一步加强[51]。

2.2 生物活性因子刺激血管重建

生物活性因子刺激血管重建是促进血管再生以克服缺氧酸性环境的主要方式。Du等[52]利用吸附VEGF 的纳米羟磷灰石/珊瑚人工骨修复犬下颌骨缺损，发现VEGF 可促进骨愈合早期血管生成。Zhang等[53]使用明胶支架联合编码缺氧诱导因子‑1α（hypoxia‑inducible factor‑1α，HIF‑1α）的腺病毒修复大鼠牙槽骨缺损，发现过表达HIF‑1α 可有效增强牙槽骨缺损中血管和新骨再生。然而，血管再生较为缓慢（每天100 μm～1 mm），受限于血管向组织工程骨内生长的固有障碍，通过恢复血流灌注以缓解低氧酸性微环境的进程过长，无法满足组织修复的时间要求[15]。

2.3 碱性人工骨替代品中和成骨微环境酸性物质

利用碱性材料，创造利于细胞生存、成骨修复的弱碱环境，方法简便，有一定的成骨效果，是组织工程学研究的新方向[33]。Shen等[54]制备的新型含锶硅酸钙（calcium silicate，CS）植骨材料表面形成的碱性环境（pH＞8）促进成骨细胞增殖并显著提高ALP 活性。Liu等[11]在骨质疏松大鼠体内植入β‑TCP、CS 以及掺入10%锶的CS（Sr‑CS）材料，与外周血不同，微环境pH 随材料种类改变和时间推移而变化。在微环境pH 较高的组别内可观察到更多新骨形成，破骨样细胞延期响应及中间磷酸盐层沉积，植入材料的碱性产物对骨质疏松性骨缺损有良好修复效果。类似的研究使用镁黄长石修复骨质疏松大鼠骨缺损，与对照组相比，镁黄长石植入后缺损区呈弱碱性并一直持续到第9周，期间可见成骨细胞活性增加，材料表面形成了与新骨结合的无机物中间层，提示其优异的骨再生性能[55]。Li等[56]通过水热处理在纯钛表面制备一系列Mg‑Fe 层状双氢氧化物（layered double hydroxide，LDH）薄膜。调节Mg/Fe 比例可控制Mg‑Fe LDHs 层间距，赋予其可调节的OH-交换能力，形成pH 可控的局部微环境。体外实验表明，Mg‑Fe LDHs薄膜修饰的钛表面具有良好的生物相容性和成骨活性，4∶1 的Mg‑Fe 比例可为大鼠BMMSCs生长和成骨分化创造适宜的碱性微环境。

3 小结与展望

微环境酸碱度影响骨再生。向碱性方向改变骨缺损区病理酸性环境是可能的骨再生疗法，碱性材料有望提高生物学性能，优化骨修复效果。然而，细胞感应胞外pH 变化并对其做出响应的机制尚未阐明，且酸碱度是非常复杂的病理生理因素，体内多种酸碱传感器和运输系统可在分子、细胞水平上严格稳定pH，揭示pH 相关信号传导的特定作用也存在一定困难[57]。未来的研究需进一步分析微环境pH 影响骨再生的机制所在，为颌面组织工程骨研发提供更深入的参考依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。