郝慧强，李姝赟，郭松佳，李荣山

1山西医科大学，太原030000；2山西省人民医院肾内科；3山西医科大学附属人民医院肾内科

外泌体是一种主要存在于细胞外的小泡，大部分细胞都可以分泌外泌体。起初认为外泌体仅与细胞内代谢废物排出相关，近年来研究证实，外泌体还具有细胞间通讯功能。细胞外小泡根据其发生部位不同分为外泌体和微泡。外泌体被认为是早期内体成熟为晚期内体（MVB）后与质膜融合被释放，直径30～100 nm［1］；而微泡是直接从质膜脱落，也被称为微粒体、胞外体等，直径50 nm～1 μm［2］。外泌体可作为生物标记物来发挥诊断价值，同时因外泌体携带体内的生理病理学信息，也可用来研究相关疾病的发病机制、治疗方法。外泌体本身也是很好的载体，可用作药物的载体靶向作用于相应器官。对外泌体进行深入研究将有助于对其功能的挖掘。因此，本文将对外泌体生物发生的相关研究进展进行综述。

1 外泌体的发生途径

外泌体的生物发生目前认为主要有质膜和内体两种途径。研究最多的是内体途径，即先由质膜出芽形成早期内体，然后早期内体萌发腔内囊泡形成MVB，最终MVB与质膜融合释放外泌体。这一机制来自于对网织红细胞成熟过程中转铁蛋白受体的研究，目前很多报道均基于这一生物发生机制定义外泌体［1］。此外，已有多项证据表明外泌体可以从质膜直接出芽形成，即质膜途径。

人类CD4+T细胞系可以通过质膜“内体样结构域”出芽直接分泌外泌体，该结构域富含CD63、CD81以及各种内体和外泌体蛋白［3］。有研究通过对外泌体标志蛋白CD63、CD81、CD9进行质膜和内体标记，发现人胚胎肾细胞、鼠NIH3T3成纤维细胞的质膜是外泌体生物发生的主要部位，这些囊泡与MVB来源的外泌体具有相同大小［4］、标记物、蛋白质以及脂质。因此有理由认为外泌体可以直接从质膜出芽产生。还有少部分细胞可能不通过MVB和质膜途径形成外泌体，如巨噬细胞［3］。巨噬细胞的质膜连接腔室（IPMC）也可能是外泌体产生的一种途径。与MVB不同的是，IPMC通过颈部与质膜相连，并与细胞外环境相通，小分子物质可以自由通过。感染HIV病毒的巨噬细胞中，IPMC是主要的病毒萌芽场所，任何打开连接膜通道的刺激都会导致病毒颗粒以及CD81/CD9的外泌体和其他膜结构的快速释放［5-6］。这一机制在其他细胞中并未发现。总之，在各种类型的细胞中，可能有不同的或主要发生途径不同的外泌体产生机制。

2 外泌体的发生机制

目前研究最多的外泌体发生机制是内体途径。早期内体产生后逐渐成熟为MVB，MVB的形成有內吞体分选转运复合体（ESCRT）依赖和ESCRT非依赖两种机制。ESCRT系统包括异源二聚体ESCRT-0（由HRS和STAM两个蛋白组成）、异源四聚体ESCRT-Ⅰ（由 TSG1010亚基、VPS28、VPS37以及MVB12组成）、异源四聚体ESCRT-Ⅱ（由EAP45、EAP30和2个EAP20组成）、ESCRT-Ⅲ（由CHMP2、CHMP3、CHMP4和CHMP6等组成）和液泡蛋白分选蛋白4（VPS4）等5个复合物以及Bro1蛋白家族（ALIX、HD-PTPT等）组成［7］。ESCRT依赖机制产生MVB需要货物聚集、膜内陷、货物运输至新生囊泡以及囊泡颈分裂4个步骤，ESCRT参与了全过程［8］。首先通过HRS：STAM（ESCRT-0）和相关的接头将货物聚集在内体膜上［7］。要想完成这一过程需要先将货物蛋白进行泛素化，然后把HRS：STAM接头通过HRS网格蛋白绑定盒连接到内体膜并形成蛋白质网络，最后通过接头捕获泛素化的货物蛋白完成聚集［9］。除上述接头外，ESCRT-I中VPS27、MVB12的C末端结构域和ESCRT-Ⅱ的EAP45 GLUE域也可与泛素化蛋白结合［10］帮助货物聚集。完成聚集后，HRS：STAM 的 HRSPASP 基序招募 TSG101［11］，形成ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ复合体，使聚集的货物定位至芽颈部并且负责背负泛素化蛋白和含有PT/SAP基序的蛋白到腔内囊泡［12］。在货物运输过程中，ESCRT-Ⅰ的VPS28的C末端结构域招募ESCRT-Ⅱ形成复合体，负责膜弯曲出芽和货物的封存，并将ESCRT-0泛素结构域募集到芽体中，在芽颈部组织ESCRT 复合物的组装［8，13］。随后 ESCRT-Ⅲ被 ESCRT-Ⅱ或ALIX招募，辅助ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ复合体完成货物封存，并通过VPS4复合体催化膜的分裂和因子的循环，最终形成 MVB［7-8］。此外，Syndecan-Syntenin-ALIX机制控制着约50%的外泌体生物发生。这一机制是通过定位于细胞膜的多配体聚糖（Syndecan）作用于其胞质受体Syntenin，并通过Syntenin的LYPXnL基序与ALIX结合，招募ALIX至胞内囊泡，刺激腔内囊泡形成和外泌体生物发生，是CD63阳性的腔内囊泡萌发必需条件［14］。

ESCRT机制并不唯一，因为多个实验室发现ESCRT机制被抑制后外泌体生物发生无实质性降低［15］。总结目前报道的其他产生途径，把他们均归入ESCRT非依赖机制。ESCRT非依赖机制中神经酰胺（nSMase）途径报道最多。研究蛋白脂蛋白（PLP）在Oli-neu细胞的膜转运机制发现，PLP不依赖于ESCRT进入内体。而nSMase抑制剂，如GW4869，可显著减少外泌体和PLP的释放，提示神经酰胺可产生另一类不被运往溶酶体，而作为外泌体分泌的腔内囊泡［16］。这一观点在其他研究中被证实。如巨噬细胞通过外泌体向树突状细胞进行抗原递呈［17］，供体细胞miRNA的转运［18］，都部分依赖于神经酰胺途径。在神经酰胺途径中，它分解产生的神经酰胺代谢物鞘氨醇1磷酸（S1P）被抑制后阻断了神经酰胺诱导的CD63外泌体的分泌，而不减少外泌体的分泌的数量，证实了S1P在腔内囊泡的货物分选中起着关键作用［19］。除神经酰胺途径外，在人类黑色素瘤细胞中CD63直接参与前黑素小体蛋白（PMEL）的ESCRT非依赖性分选，而CD63抑制后PMEL以ESCRT依赖的方式进行降解［20］；在人胚肾293细胞（HEK293），CD82和CD9促进装载β-连环蛋白的外泌体排出［21］；在胰腺癌中通过四旋蛋白8募集特定的蛋白和mRNA到外泌体［22］。这些机制均被发现是非依赖ESCRT的外泌体形成途径。但无论通过抑制哪种产生途径，都不能完全消除外泌体的产生［15］。这提示，同一种细胞有多种产生MVB的途径，同一个MVB会同时存在不同途径来源的腔内囊泡。此外，也有研究报道了在同一种细胞存在不同的MVB亚群，通常会与溶酶体结合而降解，而一部分会与质膜结合进行胞吐，将外泌体释放入细胞外空间［23］。

3 外泌体内容物的组装

外泌体内有核酸（包括miRNA、IncRNAs、mRNAs、DNA）、脂质、蛋白质等，其内容物的摄取可能经过精细的调控。相对于细胞和微囊，外泌体富含特定的RNA种类［24］。关于RNA如何被选择性的装载到外泌体，目前文献报道可能与以下几种方式相关。RNA诱导沉默复合物（RISC）参与miRNA和miRNA-mRNA复合物在外泌体中的分泌［25］。RISC的关键组件Argonaute 2（Ago2）的水平和Ago2磷酸化都控制着特定miRNA分泌到外泌体中，并受KRASMEK-ERK通路的调节［26］。除RISC之外，其他蛋白也可将特定蛋白的RNA装载至外泌体中。如主穹窿蛋白在肿瘤细胞中被发现可将miR-193a装载入外泌体排出而减少了其在细胞质中的浓度，这有利于肿瘤细胞的生长［27］；人ELAVL蛋白在饥饿应激反应期间控制miR-122向外泌体中的运输；RNA Y盒结合蛋白1在分选小非编码RNA（tRNA、Y-RNA、Vault-RNA、miRNA）到外泌体中发挥作用。上述报道可见外泌体RNA的分选依赖于某些特定的蛋白，这些蛋白如何从众多的RNA中识别需要分选的RNA目前还不清楚，但在上述报道中提示可能与RNA的修饰和特定的基序相关。部分RNA分选到外泌体已被证实需要依靠特定基序，如在原代T淋巴母细胞中，异质性胞核核糖核蛋白A2B1通过识别特定的miRNA基序将miRNA载入外泌体中，而SYNCRIP蛋白与另一种外泌体特定miRNA基序结合将装载到外泌体中，并且上述两种蛋白对靶向的miRNA具有专一性。此外，有研究通过对人类B细胞外泌体RNA进行测序发现，3'端尿苷化的miRNA在外泌体中富集［28］。研究均证明靶向外泌体的RNA具有特定的序列。因此，通过对RNA的修饰或具有特定的RNA基序是RNA靶向外泌体的关键。除RNA外，DNA也存在于外泌体中，包含线粒体DNA、单链DNA、双链DNA、基因组DNA、逆转录转座子RNA转录体等，但其分选入外泌体的具体机制尚不清楚。

上文已提到泛素化或含有PT/SAP基序的蛋白可通过ESCRT载入外泌体。除此外，通过低聚物寡聚化（或称为高阶寡聚化）和质膜结合的方式也可以将蛋白靶向到外泌体中，并且用抗体诱导细胞表面蛋白高阶寡聚化和添加质膜锚给高度寡聚的胞质蛋白两个独立的实验进行了验证［29］。有研究进一步证实了这一结论，并且发现了多种质膜锚，但出芽率存在较大差异。其中二磷酸和肉豆蔻酰化最高，同时还发现内体膜锚并不能将蛋白质靶向外泌体和微囊中［30］。此外，许多外泌体蛋白均是与膜相关、高阶化、同源寡聚和（或）异源寡聚的蛋白复合物，如四跨膜蛋白（如CD63、CD81、CD9）、逆转录病毒Gag蛋白、ESCRT机制蛋白、多种支架蛋白等［12］。外泌体还富含胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和磷脂酰丝氨酸，并且脂质参与了外泌体的结构组成，在外泌体的形成和释放中也发挥重要作用［31］。

目前研究可见外泌体不仅通过MVB与质膜融合释放，也可以通过质膜直接产生，并且某些细胞还可能有特殊的产生途径。外泌体内容物组装的研究发现，蛋白质和核酸需具备特定的条件，才可以装载入外泌体中。这些研究为进一步向外泌体装载特定的货物提供了依据。外泌体生物发生机制的研究虽未明了，但对于它功能的研究已经全面展开。外泌体的通讯功能已被发现参与多种生理病理过程，例如免疫调节、血管生成、止血、凝血、癌症、细菌病毒感染等。有多项研究通过提取尿液、血液中的外泌体进行内容物分析后发现其中的miRNA、circRNA、mRNA等分子具有显著的表达差异，但仍需要大样本实验数据支持。外泌体可以作为载体，通过定向改造进行大分子递送和基因组修饰来发挥治疗作用，这将是一场革命。对外泌体发生作用机制的深入理解，将有助于外泌体的分离提纯、靶向、改造等多方面的应用。