孙娟，杨莉娜 ，崔昊晶，胡文良，苏琳，2

1内蒙古医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，呼和浩特010000；2内蒙古医科大学研究生学院

喉癌作为头颈部最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人们健康。目前，喉癌的诊疗取得了一定进展，但尚未获得令人满意的诊疗策略，多数患者确诊时已为中晚期，总体预后较差。喉癌预后预测仍是临床一大难题。因此，寻找能够预测患者预后的分子标志物和治疗新靶标意义重大。铁死亡是近年来新发现的细胞程序性死亡的一种方式，逐渐成为肿瘤领域研究的热点。研究表明，铁死亡具有抑制肿瘤（胰腺癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤）细胞增殖，增加化疗药物敏感性等作用［1-4］。此外，铁死亡与头颈部鳞状细胞关系密切，抑制Glutaredoxin5基因表达能够使顺铂耐药的头颈部鳞癌细胞发生铁死亡［4］。可见铁死亡基因在头颈部肿瘤发生发展中发挥重要作用。但迄今尚无独立研究喉癌与铁死亡基因关系的文献报道。本研究基于美国癌症基因组图谱（TCGA）数据库，通过生物信息学方法筛选与喉癌预后相关的铁死亡基因，并建立预后预测模型，以期为喉癌的诊疗及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取TCGA数据库中2000—2020年收录并具有完整随访信息的喉鳞状细胞癌样本96例，均来自术后喉鳞状细胞癌患者，均经病理检查确诊。纳入标准：术前未进行放疗或化疗；首次进行手术治疗；随访时间均超过1年；病历资料完整。患者男82例，女14例；年龄≤65岁65例，＞65岁31例；肿瘤等级G1～G2级40例，G3～G4级56例；肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期51例；原发肿瘤浸润T1～T2期17例，T3～T4期79例；淋巴结转移N0期41例，N1～N3期55例。下载该喉癌数据集相关转录组测序RNAseq数据及样本相关临床数据，用于后续分析。本研究经内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准（2017MS0838）。

1.2 喉癌中铁死亡基因筛选 基于美国国家生物信息中心数据库挖掘能够调控肿瘤发生发展的铁死亡基因60个，用于后续对照分析。用R语言limma包提取96例喉癌样本中铁死亡基因，并进行差异表达分析，错误发现率检验（FDR）＜0.05为基因差异表达。

1.3 与喉癌预后有关的铁死亡基因筛选 用R语言limma包提取TCGA喉癌样本的存活时间及存活状态（96例患者存活60例，死亡36例，随访时间2000—2020年），用R语言survival包对基因与喉癌预后时间的关系进行COX单因素回归分析，P＜0.05被认为与预后相关，风险比（HR）＞1代表该基因表达量与预后呈负相关，即基因表达量越高，预后越差；HR＜1则相反。将差异表达铁死亡基因与预后相关基因取交集后，获得与预后相关的铁死亡基因。同时绘制森林图，HR＞1为高风险基因，HR＜1为保护基因。用R语言pheatmap包绘制预后相关铁死亡基因表达热图。

1.4 喉癌中铁死亡基因相关风险模型建立及效能评估 基于LIANG等［5］的研究方法，利用LASSO回归对TCGA样本进行风险评分，风险值根据以下公式得出：风险值表示回归系数，xi表示基因相对表达值。独立变量是铁死亡相关预后基因的标准化表达矩阵，而响应变量是TCGA队列中患者的总体生存率和生存状态。确定模型的惩罚参数（λ）并遵循最低标准（即对应于最低的部分似然偏差的λ值）进行10倍交叉验证。根据每个基因的标准化表达水平及其相应的回归系数计算患者的风险评分。用这3个铁死亡基因的表达量进行LASSO回归分析，在模拟1 000次运算后，计算出基于每个独立基因，或每两个基因，或全部3个基因的分组结果，结果显示根据HSPB1、FTH1基因的风险评分中位数（-2.568分）得到的分组结果最优。基于R语言survival包进行铁死亡基因联合预测喉癌患者生存率。利用R语言survival ROC包建立时间依赖性的ROC曲线以评估铁死亡基因相关风险模型对喉癌预后的预测价值。

2 结果

2.1 喉癌中与喉癌预后相关的铁死亡基因 共筛选出3个铁死亡基因与喉癌预后相关。PHKG2（HR=0.409，95%CI：0.199～0.842，P=0.015）、HSPB1（HR=1.842，95%CI：1.022～3.320，P=0.042）、FTH1（HR=1.708，95%CI：1.131～2.580，P=0.011）。其中，HSPB1、FTH1为高风险基因，PHKG2为保护基因。与正常样本对比，PHKG2在喉癌样本中低表达，HSPB1、FTH1在喉癌样本中高表达。

2.2 铁死亡基因风险模型对喉癌预后的预测价值 该模型预测喉癌患者术后1、2、3年生存率的ROC线下面积分别为0.657、0.691、0.770。且随时间延长，该模型的敏感度、特异度逐渐升高。

3 讨论

研究认为细胞死亡主要分为凋亡和坏死。随着研究不断深入，细胞还可通过自噬、胀亡、焦亡等方式死亡［6-7］。此外，铁死亡是2012年发现的一种铁依赖的细胞程序性死亡形式之一，涉及多种疾病，有望成为肿瘤治疗的新方式［8］。研究发现，细胞铁死亡过程会受复杂的基因网络调控，如核因子E2相关因子2能够通过调控铁死亡和线粒体功能障碍参与神经变性过程［9］。肿瘤抑制因子TP53可通过抑制溶质载体家族7成员11或过表达亚精胺/亚精胺N1-乙酰转移酶1、谷氨酰胺酶2，影响铁死亡基因网络，从而促进细胞铁死亡［10］。

本研究通过文献挖掘收集了与铁死亡相关的基因60个，并以此为靶点进行分析。本研究共发现喉癌预后相关铁死亡基因3个，分别为两个高危基因PHKG2、FTH1，1个保护基因HSPB1。研究发现，抑制谷胱甘肽过氧化物酶4的小分子会引起脂质过氧化物的致死性积累，并导致铁死亡。在这个过程中，PHKG2能够调节脂氧合酶的铁利用量，进而使不饱和脂肪酸发生氧化，从而驱动铁死亡［11］。PHKG2在喉癌中的作用尚不清楚。本研究发现PHKG2高表达是喉癌预后的高危因素，这可能与PHKG2通过调节铁死亡通路来促进喉癌发生发展有关。研究证实，FTH1能够通过吞噬铁蛋白来抑制铁死亡的发生，这使得FTH1能够抑制铁死亡促进多种癌症（肝癌、膀胱癌等）的发生发展［12-13］，但FTH1在喉癌中的作用还不清楚。本研究发现，FTH1是喉癌预后的高危因素，提示FTH1可能在喉癌中也具有促癌作用。HSPB1是癌细胞铁死亡的负性调节剂。蛋白激酶C介导的HSPB1磷酸化可通过减少铁介导的脂质反应性氧化而抑制铁死亡，从而提高抗癌活性［14］。在裸鼠成瘤实验中过表达HSPB1后，癌细胞的铁死亡明显增强。本研究发现，HSPB1是喉癌预后的保护因素。以上结果提示HSPB1、PHKG2、FTH1能够通过调控铁死亡过程影响癌症的发生发展，然而它们在喉癌中的作用尚不清楚。本研究发现它们与喉癌的预后关系密切，可能是喉癌发生发展的重要调控因子。

目前，临床主要根据肿瘤组织病理、淋巴结活检及远处转移来预测喉癌患者的预后。然而，以上预测也存在较大差异，需要补充其他辅助手段进而提高预测准确性［15］。本研究通过LASSO回归等方法建立喉癌预后预测模型，以期为喉癌患者的预后预测找寻新的靶点。该模型基于铁死亡基因HSPB1和FTH1的表达将喉癌患者分为高风险组和低风险组，生存曲线证实两组生存率有显著差异，survStat分析结果也佐证了这一结果。ROC曲线提示该模型随生存时间延长其敏感度和特异度随之升高。这提示该模型具有较强的预后预测能力。然而，该模型对喉癌患者的危险评分能够与肿瘤分期作用相当，提示该模型具有重要的临床价值。在未来，临床中可能通过检测喉癌患者样本中HSPB1和FTH1的表达量，来判断喉癌患者是否处于高风险组，从而达到预测预后的目的。此外，与其他研究［16］相比，本研究的创新点在于将研究范围精准缩小，重点探索铁死亡基因对喉癌预后的判断及影响，有助于喉癌发生新机制以及喉癌预后预测等方面的深入研究。这是首个根据铁死亡基因建立的喉癌预后预测模型。结果显示，这一模型能够准确区分高危风险与低危风险喉癌患者，而且具有很高的敏感度和特异度，具有成为辅助预后预测靶点的潜力。此外，在独立危险因素分析中，喉癌的肿瘤分期是独立危险因素之一，这符合恶性肿瘤的性质特点。与肿瘤分期相比，本研究中的预测模型同样能够作为喉癌预后独立危险因素。尽管得出上述结论，但有关这3个铁死亡基因在喉癌中的作用及机制的临床、基础研究很少，仍需进一步研究证实三者在喉癌中的作用。

综上所述，基于TCGA和生物信息学方法构建喉癌预后预测模型，结果显示HSPB1是喉癌预后的保护因素，PHKG2和FTH1是喉癌预后的高危因素。该模型具有较高的敏感度和特异度，可能为喉癌的诊疗及预后评估提供新的切入点。