李 琪，郭娇娇，阮文科

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

伪狂犬病(Pseudorabies，PR又名Aujeszky's disease，AD)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一种急性传染病，可引起包括猪、绵羊、牛、犬在内的35种动物发病，且猪是其唯一自然宿主[1-2]。在中国，伪狂犬病是规模化养殖场的常见病[3]。

伪狂犬病毒主要侵害猪的神经系统，出现肢体抽搐等症状；妊娠母猪出现繁殖障碍，并且可垂直传播给仔猪，造成仔猪死亡；种公猪失去配种能力等[4]。该病没有特效药，只能通过对病猪注射高免血清，健康猪进行紧急接种，治疗效果不佳，给养殖场造成严重的经济损失[5]。做好防疫是预防本病的关键措施[6]。在加强免疫接种的同时，合理的诊断测定方法也十分重要[7]。

该研究旨在针对TK-/gG-双基因缺失疫苗建立伪狂犬病毒酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，通过检测伪狂犬病毒gG蛋白的抗体，从而区分出疫苗接种猪和野毒感染猪，为养殖场进行大范围检测免疫效果和感染情况提供科学有效的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

伪狂犬病毒Beijing14-1株由北京农学院动物科学技术学院兽药与疫病防控实验室保存；BL21感受态细胞购自全式金生物技术有限公司；pET-32a质粒购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司；待检猪血清来自规模化猪场。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、T4 DNA连接酶、ProteinIso®Ni-NTA Resin、DNA胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；EcoRⅠ和HindⅢ购自takara公司；96孔板购自corning公司；HRP标记羊抗猪二抗购自北京冠星宇公司；BSA购自Biotopped公司；DNA和蛋白Marker、质粒提取试剂盒购自索莱宝公司、His标签一抗购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 引物设计

根据NCBI中公布的伪狂犬病毒全基因组序列(登录号：NC-006151)，运用DNAstar protean软件分析gG基因主要抗原区域并设计特异性引物，预期扩增长度为414 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物：5′-CGGAATTCTACGCCGACTACTACGACG-3′(EcoRⅠ)，下游引物：5′-CCAAGCTTGGGTCGGCTCCGG-3′(HindⅢ)。

1.4 重组质粒pET-32a-gG的构建

以伪狂犬病毒DNA为模板，用1.3中设计的引物，通过PCR方法扩增伪狂犬病毒gG部分核酸序列。PCR反应体系(20 μL)：Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，模板1 μL，上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。将PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化，并将回收产物和pET-32a质粒分别用EcoRⅠ，HindⅢ进行双酶切，再将两者用T4连接酶连接；连接体系为pET-32a酶切产物2 μL，PCR产物13 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，连接温度为25 ℃，连接15 min。将获得的重组质粒按照常规方法转化大肠杆菌DH5α中，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒测序鉴定，由上海生工公司进行测序。pET-32a载体含有可与插入基因融合表达的His标签，测序鉴定后获得重组表达质粒pET-32a-gG。

1.5 重组质粒的诱导表达与纯化

将重组质粒pET-32a-gG转化入表达菌BL21中，于菌液OD600=0.6左右，加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)进行诱导表达，同时设未经诱导的对照组。诱导表达4 h后，通过SDS-PAGE检测表达情况。为探究gG蛋白以何形式表达，将菌液超声破碎后上清和沉淀分开处理，并通过SDS-PAGE检测。再对最佳诱导条件进行探究，并在此条件下对诱导上清进行Western Blot鉴定，分别使用His单抗作为一抗检测gG蛋白，伪狂犬病毒阳性猪血清作为一抗检测蛋白反应原性。最后用全式金ProteinIso©Ni-NTA Resin进行蛋白纯化，并获得His标签融合表达的重组gG蛋白片段。

1.6 伪狂犬病毒重组gG蛋白片段抗体间接ELISA方法的建立及血清样品检测

1.6.1 伪狂犬病毒重组gG蛋白片段抗体间接ELISA方法的建立 经过抗原包被浓度、抗体稀释度以及封闭液和反应条件的优化，最终建立检测步骤。

包被：向96孔板中加入小片段gG抗原1.092 μg和抗原包被液100 μL，37 ℃ 2 h或4 ℃过夜。洗液200 μL洗涤，3次，每次静置3 min。

封闭：向每孔中加入封闭液200 μL，37 ℃ 1 h或4 ℃过夜。洗液200 μL洗涤，3次，每次3 min。

加样：分别在阴性对照孔、阳性对照孔加入阴性对照、阳性对照各100 μL(50倍稀释)，待检孔第1孔加待检血清100 μL(50倍稀释)，后孔对待检血清做倍比稀释，不要触及孔底和孔壁，轻晃混匀。

温育：用封板膜封板后置37 ℃，30 min。洗液200 μL洗涤，3次，每次3 min。

加酶标二抗：每孔加酶标抗体100 μL(用二抗稀释液20000倍稀释)。

显色：显色剂A液与显色剂B液等量混匀，每孔100 μL，37 ℃避光显色10 min。

终止：每孔加终止液50 μL。

测定：15 min内，以450 nm波长检测每孔OD值。结果判定：S/N≥2.1可判为阳性。S是待检孔的OD450平均值；N是阴性孔的OD450平均值。

1.6.2 血清样品检测 在1.6.1所述的最佳条件下，运用本试验建立的伪狂犬病毒 gG重组蛋白间接ELISA方法对样品进行检测。检测样品来自不同规模化猪场的血清样本共93个，其中包括gG缺失苗免疫的试验猪血清30个、未注射疫苗但具有非gG缺失苗母源抗体的试验猪血清48个以及非gG缺失疫苗免疫过的猪血清15个。

2 结 果

2.1 重组质粒诱导表达后菌液、上清及沉淀的SDS-PAGE鉴定

将重组质粒pET-32a-gG转化入表达菌BL21中，并进行诱导表达。pET-32a-gG质粒在经1 mmol/L的IPTG诱导后，在40～50 kD之间出现目的条带，未经诱导的菌液未出现目的条带，见图1A。

为确定目的蛋白的存在形式，将菌液超声破碎后离心，分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。上清中有大量表达带，沉淀中未见表达带，表明目的蛋白以可溶的形式存在于上清中，见图1B。

2.2 重组伪狂犬病毒 gG抗原片段Western Blot鉴定

在1 mmol/L IPTG，30 ℃，250 r/min的最佳诱导条件下，对诱导的上清进行Western Blot鉴定，分别使用His标签单抗和伪狂犬病毒阳性猪血清作为一抗，HRP标记羊抗猪二抗，结果见图2。两种方法均能检测到目的条带。

2.3 样品检测

用1.6.1所述的gG-ELISA测定方法检测来自不同规模化猪场的血清样品共93个，判定标准：S/N≥2.1可判为阳性。S是待检孔的OD450平均值；N是阴性孔的OD450平均值。阳性对照为感染伪狂犬病毒野毒的猪的阳性血清，阴性对照为未感染伪狂犬病毒野毒并且也未接种伪狂犬病毒疫苗的猪血清。

检测猪场样品93份。阴性样品30个，为gG缺失苗免疫的试验猪血清，来自阴性猪场，该试验猪没有自然感染伪狂犬病毒野毒，也没有进行非gG缺失苗免疫；弱阳性样品48个，为未免疫伪狂犬病毒疫苗，但具有非gG缺失苗母源抗体的试验猪血清，来自阳性猪场；阳性样品15个，为非gG缺失疫苗免疫过的猪血清，来自阳性猪场。93份样品检测后进行符合率计算。根据试验猪血清的不同来源及猪场的情况，检测结果与预期的结果一致，符合率100%。检测结果及符合率见表1。

表1 血清样品检测结果Tab.1 The test result of serum samples

3 讨 论

伪狂犬病自1947年在中国发现首例以来，已在中国流行70年[8]。伪狂犬病依旧是威胁中国养猪业的重要猪病之一，加强科学饲养指导，制定合理的免疫程序，加强伪狂犬病毒抗体检测，是防控伪狂犬病，净化猪场的重要防控措施[5]。目前，针对伪狂犬病毒的疫苗有灭活疫苗、自然弱毒疫苗、基因缺失疫苗等[9]。由于灭活疫苗存在免疫效果不佳，接种剂量大的缺点，天然弱毒疫苗存在TK基因，毒力返强的可能性大，可能造成接种猪免疫抑制等，逐渐被基因缺失疫苗所取代[10-11]。基因缺失疫苗以缺失TK基因作为基础，有单基因缺失、双基因缺失及多基因缺失疫苗，中国较为常用的基因缺失疫苗有TK-/gG-、TK-/gE-及TK-/gC-等双基因缺失疫苗[9]。TK-/gG-疫苗株是利用一株碘脱氧尿感抗性突变株HR(TK-)作为亲本构建的一种双基因缺失疫苗株[12]，其缺失gG基因，不会表达gG蛋白，因此通过检测血清中gG蛋白抗体即可鉴别野毒感染猪和疫苗免疫接种猪。

目前，研究者以检测gE蛋白抗体的ELISA试剂盒作为研究关注的重点[3,13-14]。对于接种TK-/gG-双基因缺失疫苗的养殖场缺乏便捷的检测方法，不利于伪狂犬病的防控。该研究通过构建伪狂犬病毒gG部分基因原核表达载体pET-32a-gG，通过加入1 mmol/L的IPTG，在30 ℃时，成功诱导表达出伪狂犬病毒gG蛋白片段，利用该蛋白作为包被蛋白，研发出检测gG抗体的gG-ELISA检测方法，检测已知猪场血清93份，其中阳性血清63份，阴性血清30份，符合率为100%。该gG-ELISA检测方法为伪狂犬病的检测带来便利，填补市场上没有针对TK-/gG-疫苗的检测方法的空缺，有利于伪狂犬病的防控。为彻底净化猪伪狂犬病提供技术上的支撑。