董雅容，杨 静，宁钧晖，王进忠，王 合，田国忠，任争光*

(1. 北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2. 北京市林业保护站，北京 100029；3. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091)

植原体(Phytoplasma)原称类菌原体(Mycoplasma-like organism，MLO)，是一种重要的原核生物植物病原菌[1]。植原体隶属软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)，候选植原体属(CandidatusPhytoplasma)，其主要特征是缺乏细胞壁，只有细胞膜包被[2-3]。植原体主要存在于植物韧皮部中的筛管细胞和介体昆虫的淋巴、肠道、唾液腺等组织内，能够引起多种农作物、园艺作物和园林植物病害，导致植物产生丛枝、黄化、花变叶、带化等症状，严重者造成植物死亡[4]。中国报道的植原体相关病害有100余种，危害严重的主要有枣疯病(Jujube witches’ broom，JWB)、泡桐丛枝病(Paulownia witches’ broom，PaWB)和桑萎缩病(Mulberry drawf，MD)等[5-6]。枣疯病是枣树生产上最严重的自然灾害，枣树一旦得病将终生带病，并具有强传染性、难以治愈，高致死性的特点，被称为枣树的“癌症”[7]。植原体与寄主的互作关系是植原体病理学研究的核心问题，由于没有细胞壁，植原体分泌的蛋白和膜蛋白直接接触寄主植物和昆虫细胞。Clark等[8-9]研究发现植原体表面参与膜组成的几种蛋白具有免疫优势活性，称之为免疫膜蛋白。目前的研究表明，植原体膜上发挥互作功能的免疫膜蛋白主要有3种，即免疫优势膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，免疫优势膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)和抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，其中Imp蛋白可以识别寄主植物的肌动蛋白并与之结合，帮助植原体固定在寄主植物筛管分子表面，Amp蛋白则能与传播昆虫的肌动蛋白和肌球蛋白互作，从而利于植原体的传播[10-11]。虽然这3种蛋白在植原体中普遍存在，但是它们之间在氨基酸序列上没有相似性，不同组别的植原体之间的同一免疫膜蛋白氨基酸序列差异也很大[12]。

研究前期对枣疯病植物样本进行了高通量测序，获得大量枣疯植原体序列，通过筛选得到编码免疫优势膜蛋白的基因imp-DZ。该研究对imp-DZ基因进行了克隆，并探索Imp-DZ蛋白的异源表达情况，为下一步深入研究枣疯植原体致病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

枣疯病样品采集自北京市昌平区发病冬枣树上。植物基因组DNA提取试剂盒，pBM30快速克隆试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)和E.coliDH5α，DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒，His标签蛋白纯化试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 枣疯植原体imp-DZ基因序列分析 根据北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室前期对枣疯病植物样品总DNA高通量测序结果(数据未发表)，筛选出枣疯植原体JWB-Dongzao编码免疫优势膜蛋白基因imp-DZ的完整序列。将该序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用Blastn软件进行比对分析，并下载其他植原体imp基因相关序列，利用DNAMAN5.0软件进行基因完全比对，用MEGA 5.2软件构建系统进化树。

1.2.2 免疫优势膜蛋白Imp-DZ特征分析 用DNAMAN5.0软件对imp-DZ基因编码的氨基酸序列进行翻译，用SignalIP4.1在线预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)对Imp-DZ蛋白的信号肽进行分析，用TMHMM v2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对Imp-DZ蛋白的跨膜区进行预测。

1.2.3 植物总DNA的提取 取0.1 g患枣疯病枣树(冬枣)幼嫩叶片，用液氮研磨成粉末，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，溶解在无菌水中，-20 ℃保存备用。

1.2.4imp-DZ基因引物设计与PCR扩增 根据1.2.2中Imp-DZ蛋白跨膜区预测结果，设计用于PCR扩增完整imp-DZ基因序列(不包含终止密码子)引物Imp-F(5′-CACCATGAGAGGAAAGAA GAAAATGC-3′)和Imp-R (5′-TTTGTTAATAACTGCAATTGCTG-3′)；同时设计引物Imp-F2(5′-CACCAAAGAAGTTTGGCCATTCG-3′)与Imp-R配对用于扩增去掉跨膜区核苷酸的imp-DZ基因部分序列。PCR反应体系和PCR反应条件参见文献[5]。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化回收。

1.2.5imp-DZ基因克隆与异源表达 将1.2.4中回收的2个DNA片段连接到蛋白表达载体pBM30上，转化至E.coliDH5α中，将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。挑选测序正确的质粒转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，获得重组菌。将重组菌接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃，150 r/min振荡培养3～5 h，菌液OD600值达到0.6～0.8时，加入IPTG(50 μg/mL)诱导表达6～8 h。将诱导好的菌液在12 000 r/min离心1 min，收集菌体，加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮5 min，置于冰上备用，即为样品总蛋白，同时用His标签蛋白纯化试剂盒对总蛋白进行纯化。样品总蛋白用15% SDS-PAGE电泳检测。

2 结果与分析

2.1 枣疯植原体imp-DZ基因序列分析结果

前期利用二代测序技术，对枣疯病样品(冬枣)总DNA进行测序，去除枣树DNA序列后，获得大量枣疯植原体JWB-Dongzao的序列，通过筛选基因注释结果，找到编码产物为免疫优势膜蛋白的基因imp-DZ，基因大小459 bp。将该基因序列放入NCBI数据库中进行核酸比对分析，imp-DZ与枣疯植原体Jwb-nky全基因组(GenBank登录号：CP025121)中一个编码假定蛋白(hypothetical protein)的基因核苷酸一致性(identity)为96%。下载其他植原体的imp基因序列，进行全基因和编码氨基酸序列比对分析(表1)。imp-DZ基因序列仅与同组(16SrV)的葡萄黄化植原体FD-C Piemonte和FD-D，榆树黄化植原体ULW的imp基因核苷酸一致性在56%左右，氨基酸一致性在30%以上，与其他植原体imp基因一致性均低于50%，说明不同植原体imp基因间的差异非常大。利用MEGA 5.2软件构建imp基因的系统发育树(图1)，JWB-Dongzao的植原体与16SrV组植原体聚在一个大的分枝上，说明imp基因仍具有一定的保守性。

表1 imp-DZ基因与其他植原体imp及相关基因一致性比较结果Tab.1 The consistency comparison of imp-DZ gene with other phytoplasma imp genes

注：枣疯植原体Jwb-nky为编码假定蛋白(hypothetical protein)基因。

Note: The gene of Jwb-nky phytoplasma was hypothetical protein gene.

2.2 Imp-DZ蛋白特征分析结果

用DNAMAN5.0软件对植原体JWB-Dongzao的imp-DZ基因进行翻译，获得152个氨基酸序列，分子量大小约为16.8 kD，等电点10.35。将Imp-DZ的氨基酸序列用SignalIP4.1软件进行分析，Imp-DZ不具有信号肽(数据未显示)。用TMHMM v2.0软件对Imp-DZ的跨膜区进行预测(图2)，Imp-DZ蛋白具有一个明显的跨膜区，跨膜区起始位置为第21个到第42个氨基酸(aa)；1-20 aa为疏水区域在细胞内部，43-152 aa为亲水区域在细胞外部。

2.3 imp-DZ基因的PCR扩增与克隆

利用引物对Imp-F/Imp-R和Imp-F2/Imp-R分别对imp-DZ的完整基因(去除终止密码子，大小456 bp)和去除编码跨膜区的核酸序列(去除前126个核苷酸和终止密码子，大小330 bp)进行PCR扩增，电泳检测结果见图3。扩增产物均在200～500 bp之间，和预计值大小相当。将两个PCR扩增片段(分别命名为I4和I3)克隆到蛋白表达载体pBM30上，阳性克隆送公司测序，测序结果经比对分析发现与高通量测序结果一致，分别得到重组质粒pBMI4和pBMI3。

2.4 Imp-DZ蛋白的异源表达结果

将重组质粒pBMI4和pBMI3分别转入菌株E.coliBL21(DE3)中，在LB液体培养基中培养6 h，分别加入IPTG后立即取菌体和诱导6 h后取菌体。菌体裂解后SDS-PAGE检测表达蛋白，结果见图4。与IPTG诱导0 h的蛋白相比，含有pBMI4的重组菌体诱导6 h后并没有出现过量表达的蛋白，而包含pBMI3的重组菌体在诱导6 h后在15～25 kD之间靠近15 kD处出现表达量明显增多的条带，大小和预计的融合蛋白一致(去除跨膜区后加上载体融合序列蛋白的大小为19 kD)；将包含pBMI3的重组菌体蛋白用His标签蛋白纯化试剂盒纯化回收，在同一位置有单一蛋白条带出现。说明克隆完整imp-DZ基因的重组质粒(pBMI4)在大肠杆菌中并没有表达，而去掉跨膜区后(pBMI3)，Imp-DZ蛋白得到大量表达。

3 讨 论

该研究从枣疯植原体JWB-Dongzao(16SrV组B亚组)的高通量测序结果中筛选到免疫优势膜蛋白编码基因imp-DZ，与imp-DZ基因序列一致率最高的是16SrV组A亚组的榆树黄化植原体ULW，C亚组的葡萄黄化植原体FD-C Piemonte和FD-D，但氨基酸一致率仅有30%左右，由此可见Imp蛋白在不同亚组成员之间仍存在着较大差异。利用imp基因核苷酸序列构建系统树，枣疯植原体同16SrV组其他植原体聚在一起，说明16SrV组植原体的imp基因仍具有共同的起源。

植原体的3种免疫膜蛋白(Imp、IdpA、Amp)虽然在氨基酸水平上无相似性，但有一些共同的特点，即都是镶嵌在细胞膜上的蛋白，靠近两端(N端和C段)有疏水区域构成的跨膜区。不同的是Imp蛋白一般具有一个跨膜区，靠近N端，C端是亲水区域裸露在细胞外部，而IdpA和Amp两端具有2个跨膜区，中间部分为亲水区域在细胞外部[13]。然而，正是由于这些跨膜区的存在影响免疫膜蛋白的异源表达。例如岳红妮等[14]在用原核表达系统对泡桐丛枝植原体PaWB-Shaanxi的Amp蛋白进行表达过程中发现，表达免疫膜蛋白全长基因和切除C端的跨膜区均未检测到相应表达蛋白。牟海青等[15]只克隆泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白amp基因中间编码亲水区域的核苷酸片段进行异源表达，结果成功表达相应的蛋白。同样的，在E.coli中表达Imp的完整蛋白时，大肠杆菌的生长受阻，表达出的蛋白较少或无法表达出蛋白，而去掉跨膜区后能成功高表达Imp蛋白[10,12]。该试验结果也证实这一现象，枣疯植原体JWB-Dongzao的Imp-DZ具有一个跨膜区，无外泌信号肽，只有去掉跨膜区后才能成功表达出Imp-DZ蛋白。这种现象可能与植原体跨膜蛋白对大肠杆菌具有毒性有关，过量表达疏水膜蛋白可能导致大肠杆菌膜蛋白合成途径饱和，导致大肠杆菌因ATP合成不足而死亡[16]。也有研究显示表达携带跨膜区的Imp蛋白主要以包涵体形式存在，另外温度，加入IPTG时大肠杆菌的浓度，IPTG的终浓度和诱导时间都会影响Imp蛋白的表达量[17]。

该研究对枣疯植原体的免疫膜蛋白imp-DZ基因进行克隆，对基因和蛋白编码序列进行分析，并在大肠杆菌中成功表达Imp-DZ蛋白，为后续特异性抗体制备和开发植原体免疫检测方法奠定基础，也为进一步了解植原体与寄主植物互作机理提供依据。