孙玉莹，于璐佳，张 杰

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

观赏海棠(Maluscrabapple)是苹果属植物中兼具观赏价值和经作价值的重要资源[1-2]。具有抗逆能力强、叶幕较大、花果叶多彩等特点，不仅作为观赏树种、环城林带建设树种用于美化城乡环境，也作为造林树种用于治理山区水土流失、风沙侵蚀等自然灾害。观赏海棠果实和叶片中含有极为丰富的天然花色素苷[3-5]，是植物体内一类重要的次级代谢产物，属于类黄酮物质并具有良好的抗氧化功能。花色素苷存在于高等植物的所有组织和器官中，使植物组织和器官呈现多种颜色，如红色、蓝色和紫色等[6-7]。同时，花色素苷在生物学功能及保健功能方面也具有多种用途，如改善视力、防止老年痴呆、预防心血管及肿瘤和糖尿病等疾病的发生[8-9]。

研究表明，低温诱导能够促进植物组织积累花色素苷[10-11]。适当的低温可以促进植物中花色素苷的积累，但是过低的温度不仅不会正向影响花色素苷的积累还会对植物造成损伤，影响其生长发育[12]。这是由于过低的温度会影响花色素苷生成途径中合成酶和调节蛋白结构的稳定性，降低其活性，减少花色素苷的积累[13]。低温促进植物中一些花色素苷合成基因和调节因子的转录翻译，进而提高花色素苷的含量。如低温可以促进花色素苷代谢途径中的PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等基因的表达，进而促进花色素苷积累[14]。苹果属植物中，低温能够诱导MdbHLH3基因的表达，进而促进MdbHLH33蛋白与MdMYBl转录因子的互作，激活花色素苷关键合成基因的表达，促进低温诱导下的花色素苷积累[15-16]。

当植物受到非生物胁迫时，为适应环境变化，抗逆相关基因启动子往往会发生去甲基化，释放沉默基因并启动转录调控，以提高植物对非生物胁迫的适应性[17]。IDM1最早在拟南芥中发现，编码一种组蛋白H3乙酰转移酶(histone H3 acetyltransferase)；在DNA去甲基化过程中，其通过自身MBD结构域识别甲基化的DNA，并通过PHD结构域识别组蛋白H3K4而产生乙酰化的H3K23和H3K18标记，随后被DNA去甲基化酶或其互作蛋白所识别而使DNA去甲基化[18]。IDM1在生物体内的正常表达对于维持DNA甲基化状态，防止超甲基化具有非常重要的作用[19-20]。

低温胁迫促进DNA去甲基化，同时促进植物体内的花色素苷的积累，但苹果属植物中DNA去甲基化与花色素苷积累间是否存在联系尚不清晰。该研究的目的旨在探索低温条件下IDM1基因参与DNA去甲基化过程与花色素苷合成途径的潜在联系，初步探明DNA去甲基化基因与苹果属植物低温诱导花色素苷积累的关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为苹果品种‘嘎啦’(Malusdomesticacv. ‘Gala’)、观赏海棠常红叶品种‘王族’(Maluscv. ‘Royalty’)和观赏海棠常绿叶品种‘火焰’(Maluscv. ‘Flame’)组培苗。组培苗试验材料均来自北京农学院组培中心，其外植体于2019年4月12日取自北京农学院苹果属植物种质资源圃的一年生枝，培养于MS培养基[21]，光照时间为光照16 h/黑暗8 h，光照强度1 500～2 000 lx[22-23]。

1.2 试验方法

1.2.1 低温胁迫处理 对照组培养温度为23～26 ℃，低温处理组培养温度为16 ℃，连续处理7 d。

1.2.2 RNA提取和反转录cDNA 将处理后的观赏海棠常红叶品种‘王族’、观赏海棠常绿叶品种‘火焰’和苹果品种‘嘎啦’组培苗叶片对照组和16 ℃低温处理组分别进行植株叶片液氮研磨，每组处理进行3次生物学重复。将每个研磨样品进行总RNA提取，提取方法参照RNA多糖多酚提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书；利用第一链反转录试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)将每个样品进行cDNA合成。

1.2.3MdIDM1基因的克隆 通过NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索，获得金冠基因组同源IDM1基因碱基序列，使用Primer.5软件根据其碱基序列设计克隆引物MdIDM1-F为5′-ATGTTTCTCAGCAAAGAAATTG-3′，MdIDM1-R为5′-TTATTCTTCCAAAGGAAGCTG-3′。PCR扩增体系参考Pfu DNA Polymerase说明书(北京博迈德基因技术有限公司)，反应条件为95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；循环数35；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。将PCR产物电泳检测、回收并测序(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 根据测序获得的IDM1基因碱基序列，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Primer-BLAST，特异性设计荧光定量PCR引物。q-IDM1-F为5′-TATCCAGCCATCGGAGGGAA-3′，q-IDM1-R为5′-CGCCCGTCGCTATTTCCTAA-3′。以16 ℃低温处理组cDNA及对照组cDNA分别为模板，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)荧光染料(北京擎科新业生物有限公司)于Bio-RAD CFX384 Thermal Cycler上进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，检测去甲基化基因MdIDM1以及花色素苷代谢过程中合成基因和调节基因的表达量。反应条件为94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，共循环35次；最后65～95 ℃制备溶解曲线。以苹果18S核糖体RNA基因(DQ341382)作为内参基因，每组处理设置3次生物学重复，每个样品进行3次技术重复。

1.2.5 花色素苷物质含量测定 以甲酸∶甲醇∶水=1∶80∶19配制成花色素苷提取液。液氮研磨的植株叶片样品，分别将每个样品称量1 g于离心管中加入2 mL花色素苷提取液，45 ℃超声1 h，12 000 g离心10 min，以直径0.2 μm的滤膜过滤上清于棕色小瓶中。将花色素苷提取液进行液相色谱成分检测(Agilent 1200，北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室)，并计算含量。花色素苷含量计算公式：花色素苷的含量(μg/g) =(0.003×A+0.3)/m。A表示峰面积，m表示样品鲜质量(g)[ 24-25]。

2 结果与分析

2.1 MdIDM1基因的克隆

以cDNA为模板，经PCR扩增、回收及测序等过程，得到1条长度为3 975 bp的MdIDM1基因序列，与‘金冠’(Malusdomestica‘Golden Delicious’)基因组MdIDM1基因进行对比，核苷酸相似度99.75%(图1)；氨基酸相似度99.47%(图2)。在NCBI上进行结构域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，显示MdIDM1蛋白存在保守的PHD1结构域(图3)。

2.2 低温处理苹果属叶片的花色素苷含量分析

为了解低温条件下苹果属植物花色素苷含量变化情况，对低温处理后的‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’3个品种的表型进行分析，结果如图4A所示。常绿品种‘嘎啦’和‘火焰’植株叶片明显变红，红叶品种‘王族’经低温处理后叶片变成紫红。利用液相色谱技术对不同处理组的3个品种的叶片进行花色素苷含量测定，‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’叶片经16 ℃低温处理后，花色素苷含量显著升高，花色素苷在3个品种中的含量都呈现升高趋势(图4B)。

2.3 低温处理苹果属叶片花色素苷合成相关基因表达分析

利用qRT-PCR技术测定3个品种叶片中花色素苷合成相关基因的相对表达量，16 ℃低温处理后花色苷合成相关基因的表达都有不同程度的升高(图5)。在‘嘎啦’中，MdCHI、MdDFR、MdFLS和MdUFGT基因的表达量上调10倍以上。‘王族’中MdF3’H基因的表达水平上调最为显著；其次MdCHI基因表达量上升6.7倍，MdMYB10的表达量上升了4.7倍，MdUFGT表达量上升了3.3倍。在‘火焰’中MdF3’H、MdFLS、MdCHI、MdUFGT的表达量显著升高，其中MdF3’H表达量上升了142倍，MdFLS表达量上升了30倍，MdUFGT和MdCHI的表达量上升14倍，MdDFR和MdANS的表达量分别上升8.5倍和8.7倍。

2.4 低温处理苹果属叶片MdIDM1基因表达分析

利用qRT-PCR技术检测3个品种叶片中MdIDM1基因的相对表达量。MdIDM1基因在3个品种中的表达量都呈现升高趋势，均升高2倍左右，与‘王族’品种中花色素苷含量上升趋势相同(图6)。

3 讨 论

花色素苷是植物中重要的次生代谢产物，是苯丙酸代谢途径的产物之一。花色素苷使植物呈现不同颜色，有利于植物繁衍后代，也利于植物抵御非生物胁迫。研究表明苹果中MdMYB1、MdMYBA、MdMYB10和MdMYB110a等MYB转录因子，结合MdCHS、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因的启动子，调控其表达的强弱。苹果属植物观赏海棠中MdMYB10基因能够响应低温、持续光照的诱导，调节MdCHS、MdF3H、MdF3’H、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因表达[5]。低温条件下，苹果‘嘎啦’和观赏海棠‘王族’及‘火焰’3个品种的叶片明显变红，通过液相色谱分析，花色素苷含量明显升高，qRT-PCR技术检测结果表明花色素苷生物合成基因表达明显升高。

DNA去甲基化是植物体内重要的表观遗传学修饰途径，DNA去甲基化可以释放基因沉默，其与DNA甲基化动态变化，增强植物体内基因组的可塑性，也使植物在受到低温胁迫时做出响应[26-27]。低温影响植物的生长和发育。当植物受到低温胁迫时，促进花色素苷的积累来防御低温对植物造成的伤害[28]。同时植物体内甲基化水平降低，大部分基因去甲基化，虽然不是直接调控低温胁迫途径相关基因，但是间接影响基因的表达[29-30]。植物为抵御温度的变化，会通过DNA甲基化和DNA去甲基化的表观遗传过程修饰基因表达，从而促成环境诱导的表型变异。已有研究表明，低温春化的小麦[31]和油菜[32]种子中DNA甲基化水平降低，并且会出现永久的DNA去甲基化现象。低温处理橡胶树苗，发现低温敏感基因HbICE1、HbCBF2和HbMET启动子低甲基化，并且许多去甲基化位点发生在低温相关转录因子识别的顺式元件上，通过对基因组分析得到12个DME基因、2个ROS基因和7个DML基因，其中HbROS1受低温诱导表达量增高[33]，因此低温诱导DNA糖基化酶的转录激活，通过DNA去甲基化途径使冷敏感相关基因的启动子甲基化水平降低，提高基因表达，增加植物对低温胁迫的耐受性。

笔者克隆获得苹果属植物MdIDM1基因，并通过对苹果属3个品种植物进行低温处理，发现低温处理能够促进苹果属植物花色素苷积累，且DNA去甲基化基因表达与花色素苷积累和花色素苷生物合成基因表达趋势一致，推测低温胁迫通过诱导MdIDM1基因的表达，降低花色素苷合成途径中关键基因启动子的甲基化水平，从而增加苹果属植物叶片和果实中合成基因的表达，促进花色素苷的积累。MdIDM1基因在苹果属花色素苷合成上的作用机制还需进一步借助于基因过表达或沉默等转基因技术的验证。