谢彤彤，付博凡，姚鑫鑫，盛熙晖，郭 勇，肖龙菲，倪和民，王相国

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206)

奶牛子宫内膜炎(Cow endometritis)是影响奶牛群体繁殖性能的一种主要疾病。奶牛子宫内膜炎会造成母牛子宫的组织损伤、胚胎的死亡、早期流产、卵巢周期推迟、黄体期延长、胎间距增大等一系列的不良后果[1-3]，同时也是引起母牛不孕和胎儿死亡的重要原因之一[4]。母牛患子宫内膜炎后，通常会导致生产性能降低，进而降低泌乳量和怀孕率，给奶牛养殖业造成严重的经济损失。这些问题在奶牛养殖业中大量存在，并且已经严重损害奶牛的繁殖性能，阻碍奶牛养殖业发展，同时，奶牛子宫内膜炎的中西药治疗使得养殖成本增加，给养殖户造成额外的经济负担。急需一种有效且廉价的方法治疗奶牛子宫内膜炎症。

北京农学院动物育种与辅助生殖实验室前期已从奶牛子宫腔液中分离并鉴定外泌体内miRNA，发现miR218在患子宫内膜炎奶牛子宫组织中的表达量显著低于健康牛子宫组织的表达量[5]。该试验拟通过大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激奶牛子宫内膜上皮细胞(Endometrial epithelial cells，EEC)构建奶牛子宫内膜炎体外模型，从培养的子宫内膜上皮细胞和脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞内分离鉴定外泌体及其中miR218的表达。通过外泌体融合和mimics 218转染检测奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体及其miRNA对减轻脂多糖诱发免疫因子释放的作用。探究奶牛子宫内膜炎诊断新的标识因子，进而为从基因水平治疗奶牛子宫内膜炎提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其培养

奶牛子宫内膜上皮细胞系购自国家实验室细胞平台。放置在培养基(minimum essential medium，MEM)(含10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)中，在37 ℃，5%CO2细胞培养箱中贴壁培养，每2 d更换新鲜培养基。

1.2 主要试剂

基础培养液MEM(赛默飞公司)、无外泌体胎牛血清(Exosomes-depleted FBS Media Supplement，安诺论公司)、脂多糖(西格玛公司)、牛肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物)、牛白细胞介素-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物)、外泌体提取试剂盒(贝博公司)和PKH26(西格玛公司)。

1.3 检测细胞增殖

细胞生长速率达到80%后，弃去培养基并用磷酸盐缓冲液洗涤，依次加入0、5、10、50、100 μg/mL(n=6)脂多糖(培养基0%FBS配置)，24 h后向每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育2 h，用酶标仪测量每个孔在450 nm的吸光度(OD)。

1.4 测定IL-1β和TNF-α

待细胞生长率达90%，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此为试验组)，另一组继续培养(此为对照组)，收集24 h后的细胞培养基，依照江莱生物牛IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附测定检测试剂盒操作，测得OD值，根据标准曲线，将OD值换算成pg/mL。

1.5 外泌体形态观察及检测

待细胞生长率达90%，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此为试验组)，另一组继续培养(此为对照组)，采集24 h后的细胞培养基，依照贝博公司外泌体(Exosomes，exo)提取试剂盒操作，分别获得脂多糖处理后外泌体和正常外泌体备用。外泌体使用负染色法，并用透射电子显微镜形态学染色。将脂多糖处理后外泌体和正常外泌体分别提取蛋白用Western Blot检测外泌体标志蛋白CD63；并且分别提取mRNA，测定其OD值。

1.6 荧光定量PCR检测基因表达

将1.5中得到的mRNA进行荧光定量PCR测定，检测子宫内膜上皮细胞来源外泌体与脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR218的表达量。

定量PCR引物，设计并合成由吉马基因完成，持家基因GAPDH的引物由上海生物合成，使用primer5.0软件设计，引物序列见表1。

表1 miR-218，GAPDH基因引物Tab.1 miR-218, GAPDH gene primers

1.7 细胞观察

细胞生长速率达到80%后，弃去培养基并用磷酸盐缓冲液洗涤，加入100 μg/mL脂多糖培养24 h，加入荧光标记试剂盒(Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit，PKH26)染色的脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体，继续培养24 h，用DAPI进行核染色，共聚焦显微镜观察。

待细胞生长速率达80%，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗，同时加入100 μg/mL脂多糖培养24 h，试验组加入子宫内膜上皮细胞来源外泌体，对照组不做操作继续培养，24 h后收集细胞培养基，依照江莱生物牛IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附测定检测试剂盒操作，测得OD值。并检测miR218在细胞中的表达。

1.8 转染细胞

待细胞生长速率达80%，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗，转染mimics 218和mimics NC到细胞中培养24 h，加入100 μg/mL脂多糖继续培养24 h，用共聚焦显微镜观察转染mimics 218的子宫内膜上皮细胞。

我们应该认识到的是，目前肥料染色问题已经从行业自律，上升到法律的约束。非有效染色剂的运用，可能涉嫌违法，并需要承担相应的法律责任，这一定不是化肥生产者愿意面对的，也是我们必须要引起重视的。如果要改变这一局面，我们需要的是依靠技术的进步。我国化肥工业界一定有能力作出改变。

待细胞生长速率达80%，弃去培养基，磷酸盐缓冲液清洗，同时加入100 μg/mL脂多糖培养24 h，收集细胞培养基，依照江莱生物牛IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒操作，测得OD值。根据标准曲线，将OD值换算成pg/mL。

1.9 统计学处理

用SPSS 20.0软件统计并分析数据。结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，*代表P<0.05，表示差异显著，**代表P<0.01，表示差异极显著。应用Graphpad prism7.0统计软件生成柱状图。

2 结 果

2.1 脂多糖对子宫内膜上皮细胞增殖的影响

脂多糖0、5、10、50和100 μg/mL，处理24 h，对子宫内膜上皮细胞增殖影响显著，见图1。脂多糖100 μg/mL，处理24 h，对奶牛子宫内膜上皮细胞增殖呈现显著抑制(P<0.05)。

2.2 脂多糖对子宫内膜上皮细胞IL-1β和TNF-α释放的影响

使用100 μg/mL脂多糖处理子宫内膜上皮细胞24 h，细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α含量均显著高于对照组(P<0.05)，见图2。说明脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞诱发炎症因子的释放。

2.3 子宫内膜上皮细胞来源外泌体分离与鉴定

采用透射电镜对两组提取的外泌体(子宫内膜上皮细胞来源外泌体和脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体)形态进行检测，见图3。提取的外泌体大小均一，直径均在30～150 nm之间，外形呈圆形或椭圆形的茶托样结构，可见明显的膜性结构，形态无较大差异(图3A，箭头所指为外泌体)，且均表达外泌体标识蛋白CD63(图3B)，子宫内膜上皮细胞来源外泌体和脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体的mRNA的OD值无明显差异(图3C)。说明从培养的子宫内膜上皮细胞和脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞内能够分离出外泌体，并且外泌体内RNA成分含量无差异。

2.4 脂多糖对外泌体中miR218表达影响

脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR218的表达量显著低于正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR218的表达量(P<0.01)，见图4。说明分离的子宫内膜上皮细胞来源外泌体与脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞来源外泌体内miR218表达出现显著差异。

2.5 正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体对脂多糖诱发免疫因子释放的影响

正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体(PKH26着色)能够与脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞融合，并与调节炎性因子释放相关的NF-Κb(p65)蛋白共定位于细胞质中(图5A)。与此同时，正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体显著抑制100 μg/mL脂多糖处理诱发的子宫内膜上皮细胞中的IL-1β和TNF-α释放(P<0.05)，见图5B。此外，正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体随着与子宫内膜上皮细胞的融合显著增加脂多糖处理子宫内膜上皮细胞内miR218的含量(P<0.05)，见图5C。

2.6 MiR218对脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞中IL-1β和TNF-α释放的影响

Mimics 218进入到被转染的脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞细胞质中，主要与磷酸化的p65(p-p65)蛋白细胞核外部分共定位(图6A)。与此同时，转染mimics 218显著抑制脂多糖刺激子宫内膜上皮细胞中TNF-α的释放(P<0.05)，而对IL-1β释放无明显影响(图6B)。

3 讨 论

3.1 脂多糖对子宫内膜上皮细胞影响

大肠杆菌所产生的脂多糖是引发机体产生免疫反应的重要因素，所以脂多糖是与子宫内膜炎相关的典型的病原分子形式[6]。有关病原学研究表明，革兰氏阴性菌感染雌性生殖道是引起不孕、早期流产及子宫感染的重要病原之一[7]。进一步的研究发现，使用革兰氏阴性菌来源的内毒素-脂多糖作为病原相关分子模式可以很好模拟细菌感染而引发炎症反应。将脂多糖作为病原相关分子形式模拟细菌感染、制作体内和体外炎症模型，已经成为子宫内膜炎相关研究中普遍利用的技术方法。大肠杆菌利用特殊的毒力因子脂多糖导致组织损伤并促进疾病，从而导致宿主对内源性免疫系统指导的细菌反应[8]。大量研究证明，动物机体以及多种细胞在体外可以被脂多糖诱导产生炎症反应[9]。研究报道，在未患有疾病的奶牛子宫内膜中，IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA水平显著低于临床型子宫内膜炎的奶牛，隐性奶牛子宫中IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA表达与临床型无明显区别[10]。该试验中，脂多糖为100 μg/mL，作用24 h时，可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞的免疫应答，并且在细胞培养上清中的IL-1α、TNF-α分泌均有大幅提高。

3.2 子宫内膜上皮细胞来源外泌体提取可用于后续研究

外泌体是通过身体的大部分细胞分泌的30～150 nm的直膜囊泡。外泌体拥有脂质双层结构层，它主要由蛋白，脂质，核酸构成[11]。外泌体可以携带DNA，编码RNA和非编码RNA和蛋白。外泌体可以作为疾病的生物标志物。一直以来人们认为，细胞之间的交流都是通过细胞间接触或者分子实现，如激素，如神经递质等。自从外泌体被发现以来，人们发现它是细胞间信息传递的方式之一，它作为细胞间交流的媒介，参与细胞间物质传递与信息传递。外泌体可以直接或者间接与靶细胞接触，进行信号传递。Rao等[12]和Khan等[13]研究表明，外泌体在肿瘤诊断、细胞迁移生长、组织修复、和其他抗原呈递外来体的免疫中起着非常重要的作用。该研究中采用的外泌体提取试剂盒分离获得外泌体，操作简单，纯度高，经过透射电子显微镜和Western Blot两种方法对外泌体的结构大小进行验证和表面蛋白验证。外泌体提取试剂盒获得的外泌体能够应用于后续试验。

3.3 MiR218调节脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞免疫因子释放

miRNA是一类非编码RNA分子，长度为22～25个核苷酸。它们通过抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解而起作用。越来越多的证据显示miRNA具有多种生物学功能，如调节细胞活力、细胞死亡和细胞迁移[14-15]。Asangani等[16]、Prasad等[17]和Tavazoie[18]目前研究证明，miR218可能参与调节肿瘤的发生和发展，例如口腔癌，急性淋巴细胞白血病，肺癌，结肠癌，胃癌和宫颈癌。外泌体中的miRNA在疾病中发生和发展情况之间的联系越来越受到研究者的关注[19-20]。外泌体作为miRNA表达时的载体是最近研究的方向之一[21]。在肿瘤领域中，miR218已被证明可通过靶向Bmi-1或ROBO等蛋白的表达抑制各种肿瘤细胞的增殖和侵袭[22]。该研究中发现转染miR218的模拟物显著抑制脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞内TNF-α的释放，对IL-1β的释放没有影响。然而，正常培养子宫内膜上皮细胞来源外泌体能够同时抑制脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞内TNF-α和IL-1β的释放。说明外泌体内不同成分共同调节脂多糖诱发的子宫内膜上皮细胞免疫因子的释放。MiR218仅仅可以作为其中的一个调控因子，调节脂多糖刺激的子宫内膜上皮细胞免疫因子的释放。

4 结 论

正常情况下，miR-218能够随着健康子宫内膜上皮细胞分泌外泌体进入到邻近细胞或其自身内，并与磷酸化p65核外部分共定位并抑制自身免疫因子的释放。当子宫内膜上皮细胞受到脂多糖刺激后，包裹进外泌体内miR218减少，从而解除其对周围子宫内膜上皮细胞免疫因子的抑制，进而加重免疫反应。