张博，马乐，薄晓菲，王雨，孙远，牛明春

（北京生物制品研究所有限责任公司，北京 100176）

支原体是生物制品细胞培养生产工艺中常见的污染物，2015年版《中华人民共和国药典》推荐使用支原体肉汤培养基检测肺炎支原体，精氨酸支原体培养基检测口腔支原体[1]。市场上检测肺炎、口腔支原体也是分别使用这两种培养基。本研究对支原体肉汤培养基在药典配方的基础上进行了配方优化后，可以替代市场上药典配方生产的支原体肉汤和精氨酸支原体肉汤培养基，用于同时检测肺炎、口腔支原体，从而达到用途及培养、检定的统一性，便于生产、研究等工作。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肺炎支原体（MP），990420，首都儿科研究所；口腔支原体（MO），ATCC23714，购自美国ATCC；精氨酸支原体肉汤培养基、肺炎支原体肉汤培养基，北京三药科技开发公司生产。

pH仪雷磁pHS-3D型，上海三信。

1.2 配制培养基

1号培养基：配方优化后的新鲜支原体肉汤培养基，成分为硫酸镁、氯化镁、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化钠、葡萄糖、L-精氨酸、酚红和精氨酸盐酸盐。2号培养基：配方优化后的干粉支原体肉汤培养基，配方同1号培养基。3号培养基：精氨酸支原体肉汤培养基配方同药典。4号培养基：肺炎支原体肉汤培养基配方同药典。其中，1、2、3号培养基接种口腔支原体，1、2、4号培养基接种肺炎支原体。

1.3 培养基合格性鉴定

4种培养基经高压灭菌后[2]第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，观察外观、检测pH值，每种培养基设4个重复；在20～25 ℃和30～35 ℃两个温度下对4种培养基进行无菌性检查。

1.4 适用性检查

1.4.1 菌种的复苏

将“1.1”中的菌种转种到支原体培养基中，（36±1）℃培养2～3 d观察复苏情况或可继续复苏一代。

1.4.2 工作菌株制备

将复苏的参考菌株转种于支原体培养基中（36±1）℃培养 2～3 d。

1.4.3 菌悬液制备

将“1.4.2”中工作菌株用支原体培养基稀释，肺炎支原体稀释到10-7～10-9，口腔支原体稀释到10-3～10-5，分别接种于4种培养基中。平行试验3次，每次接种中管各4支。接种之前4种支原体培养基中应按20%的比例加入马血清。

1.4.4 培养观察

（36±1）℃培养7～14 d，观察培养基颜色变化（变红或变黄）及变色管数，以判定该培养基的变色单位。支原体培养基变色单位应达到[1]：肺炎支原体10-8、口腔支原体 10-4。

2 结果与分析

2.1 外观检查

如图1所示，4种培养基在灭菌后0～28 d外观澄清透明，1号培养基较比其他3种培养基颜色深。

2.2 pH值监测

1、2、4号培养基合格pH值为7.4～7.8，3号培养基合格pH值为6.9～7.3。如表1所示，第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，4种培养基在灭菌后pH值全部在合格范围内。

表1 4种培养基pH值变化情况

2.3 无菌性检查

4种培养基在20～25 ℃和30～35 ℃下培养28 d均无杂菌生长。

2.4 适用性检查

2.4.1 口腔菌株接种结果

表2为口腔菌株的接种结果。用统计学方法进行数据处理，发现在规定的检定周期内，口腔菌液3个稀释度接种的优化培养基（1号、2号）与药典配方精氨酸支原体肉汤培养基（3号）阳性管数差异无显著意义（χ2=0，P=1.000 0）[3]。

表2 口腔菌株接种结果

接种口腔支原体菌液的3号、2号、1号培养基阳性灵敏度变色有差异。在第3 d时，稀释度为10-3的1号、2号培养基已肉眼可见有颜色变化，但无法用影像显现；第4 d，1号、2号培养基已明显优于3号培养基，且3次平行试验结果完全一致。

图1 培养基外观检查

2.4.2 肺炎菌株接种结果

表3为肺炎菌株的接种结果。用统计学方法进行数据处理，发现在规定的检定周期内，肺炎菌液3个稀释度接种的优化配方培养基（1号、2号）与药典配方支原体肉汤培养基（4号）阳性管数差异无显著意义（χ2=0，P=1.000 0）[3]。代药典配方并应用于口腔支原体和肺炎支原体的同时检测。

表3 肺炎菌株接种结果

图2 肺炎菌株接种实物图

如图2所示，为肺炎菌株接种图，接种肺炎支原体菌液的1号、2号、4号培养基灵敏度无显著差异。

3 结论

优化配方制备的支原体肉汤培养基从质控项目到使用效果与药典配方制备的肺炎支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基结果无差异，可完全替