陈广栋，林锦雄，李秋英，冉亚妮，邱献玲

（广州艾蓓生物科技有限公司，广东广州 510850）

化妆品是在基质（水或油性原料）中添加各种有效成分经过多道生产工序制作而成的日用化学产品，常添加有水溶性高分子化合物、表面活性剂、防腐剂、香精等成分。因此，化妆品既能满足消费者对美的追求，在生产、储存、运输、使用的过程中也很容易受到微生物的污染。在化妆品配方设计的过程中，防腐体系的构建是其中重要的一环，化学成分防腐剂构建的防腐体系虽然稳定高效，但刺激性与致敏率也相对较高，植物成分组配的防腐剂、无添加防腐剂因其低刺激性与致敏率逐渐成为化妆品防腐体系构建研究的热门方向。在化妆品防腐体系构建过程中，为保证化学成分防腐剂、植物成分组配的防腐剂或无添加防腐剂所构建的化妆品防腐体系能够满足人们日常使用的要求，需要开展微生物试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 化妆品样品

试验用化妆品制作过程经过严格的无菌控制，防腐剂成分及含量明确。

1.1.2 防腐剂

化学成分防腐剂：羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲；植物成分组配防腐剂：明串球菌/萝卜根发酵产物滤液、秦椒果提取物/朝鲜白头翁提取物/须松萝提取物；无添加防腐剂：辛酰羟肟酸（抗氧化剂）、对羟基苯乙酮（保湿剂）、己二醇（保湿剂）、戊二醇（保湿剂）、辛甘醇（螯合剂）。

1.1.3 试验用菌种

细菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单胞菌；酵母：白色假丝酵母；霉菌：黑曲霉。以上菌种均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.1.4 试验用仪器

YXQ-LS-100SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；1244 Ⅱ级生物安全柜，美国BioX科技有限公司；LRH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；BagMixer® 400拍打式无菌均质器，法国INTERSCIENCE公司。

1.1.5 试验用培养基

大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）；D/E中和肉汤。

1.2 微生物试验方法

1.2.1 试验前增菌

细菌：从菌种斜面挑取并接种于TSA斜面上，在35 ℃下培养18～24 h；白色念珠菌：从菌种斜面挑取并接种SDA斜面上，在25 ℃下培养44～52 h；黑曲霉：从菌种斜面挑取并接种SDA斜面上，在25 ℃下培养6～10 d，或者更长的时间，以便获得足够的孢子[1-2]。

1.2.2 试验接种菌液制备

用0.9% NaCl稀释液洗脱细菌和白色念珠菌斜面并收集在相应的试管中。用添加0.5%吐温80的0.9% NaCl稀释液洗脱黑曲霉斜面，孢子悬浮液用无菌工具去除菌丝。用比浊法和血球计数法将细菌菌液浓度调节至约5.0×108CFU/mL，霉菌、酵母菌菌液浓度调节至约5.0×107CFU/mL。用平板法计数，此活菌计数结果用于计算接种后样品初始菌液浓度，用lg值在结果报告中表示。细菌和酵母菌悬液在2 h内使用，贮存在2～8 ℃环境中24 h内使用，黑曲霉孢子悬液可在2～8 ℃环境中保存7 d。

1.2.3 防腐体系构建

如表1所示，构建18个防腐体系，进行微生物试验。

1.2.4 样品接种

在50 g样品中分别加入上述制备好的（混合）细菌初始菌悬液100 μL，确保（混合）细菌在样品中的接种浓度为1.0×106CFU/mL；另取50 g样品分别加入上述制备好的（混合）霉菌初始菌悬液100 μL，确保（混合）霉菌在样品中的接种浓度均为1.0×105CFU/mL。将接种菌液后的样品用搅拌棒充分搅拌混匀后置于22.5 ℃保存。

表1 防腐体系构建

1.2.5 取样测定

在接种后的0 d、7 d、14 d、21 d和28 d取样进行测定，检验方法按化妆品安全技术规范[3]进行。

1.2.6 评价标准

盥洗用品和香精协会（CTFA）的方法规定初始的（混合）细菌和（混合）霉菌的接种量分别为106CFU/g(mL)和105CFU/g(mL)，要求在第7 d时细菌减少99.9%，霉菌减少90%，并且在28 d内菌数持续下降。美国药典（USP）在CTFA评价方法的基础上提出更为严格的标准：若单菌接种的3个平行试验中任何一种微生物数量的平均值在第7 d时下降到100 CFU/g(mL)以下，28 d全部为0，则视为效果优良；通过试验若第7 d天时下降到1 000 CFU/g(mL)以下，则视为勉强通过；若混菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求，防腐体系则评定为无效[4-6]。

2 结果与分析

18个防腐体系对（混合）细菌和（混合）霉菌的抑杀作用见表2和表3。由表2和表3可知，化学成分防腐剂与植物成分防腐剂构建的化妆品防腐体系要优于无添加防腐剂，且无添加防腐剂构建的化妆品防腐体系没有1例是优良的，表现并不理想；表2中第7号、13号样品以及表3中第14号、17号样品，其含菌量在加菌后第28 d均大于21 d时的含菌量，说明样品中的防腐剂对添加的微生物只是起到一定的抑制作用，并不能有效杀灭，当样品的防腐效能下降或添加的微生物对样品的防腐剂出现耐药性时，添加的微生物又开始进行繁殖。

3 结论

本研究通过微生物试验，对化妆品的防腐体系进行了构建与优化，确认了11种防腐剂在化妆品配方中的添加比例以及防腐效果：（1）由羟苯甲酯添加0.2%，羟苯丙酯添加0.2%，苯氧乙醇添加1%，明串球菌/萝卜根发酵产物滤液添加3%～4%，秦椒果提取物/朝鲜白头翁提取物/须松萝提取物添加1%分别构建的化妆品防腐体系防腐效果为优良；（2）由苯氧乙醇添加0.8%，咪唑烷基脲添加0.6%，明串球菌/萝卜根发酵产物滤液添加2%，秦椒果提取物/朝鲜白头翁提取物/须松萝提取物添加0.6%，辛酰羟肟酸/己二醇/辛甘醇添加1.5%，辛酰羟肟酸/戊二醇/辛甘醇添加1.5%分别构建的化妆品防腐体系防腐效果为勉强通过，需要重新调整；（3）由羟苯丙酯添加0.1%，咪唑烷基脲添加0.2%，明串球菌/萝卜根发酵产物滤液添加1%，秦椒果提取物/朝鲜白头翁提取物/须松萝提取物添加0.4%，对羟基苯乙酮/辛甘醇添加0.6%，己二醇/辛甘醇添加0.6%分别构建的化妆品防腐体系防腐效果为无效，需要重新调整。通过化妆品微生物试验的测试，可以为化妆品配方中防腐剂防腐效果提供有效的数据参考。

表2 （混合）细菌一次加菌28 d微生物试验结果

表3 （混合）霉菌一次加菌28 d微生物试验结果