杨 斌 孙洮玉 刘 真 崔 晔 徐春英△

（1.中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

变应性鼻炎（AR）是变应原刺激下IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎症。流行病学调查显示，我国城市AR患病率平均为11.1%，全球AR患者人数超过5亿［1］。AR如未得到有效控制，可导致鼻窦炎、哮喘等疾病发生［2］，因此对AR患者进行有效干预治疗，对防止其恶化具有重要意义。玉蝉卫肺丸是西苑医院院内制剂，具有补气健脾散风之功，临床上取得了较好的疗效［3-4］。本研究通过观察AR大鼠鼻腔分泌物中嗜酸粒细胞数量、血清IgE水平、鼻黏膜组织病理改变以及肥大细胞表达，探究玉蝉卫肺丸对AR的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，4～6周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0001。大鼠饲料喂养，自由饮水，室温（22±2）℃，湿度（55±15）%，并通过本院动物实验伦理研究委员会同意。

1.2 试药与仪器 玉蝉卫肺丸，由黄芪、玉竹、蝉衣、防风、白芷组成，生药量4.25 g/丸，院内制剂号：京卫药制字（087）第F-1246号。氯雷他定片（西安杨森，10 mg/片，批号：050218967）。卵清蛋白（OVA）（批号A5253-1009，Sigma），氢氧化铝凝胶［Al（OH）3］（批号A8222-250，Sigma），MC小鼠单克隆抗体（货号ab2378，Abcam），酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（批号1919D0516，中杉金桥）。全自动多功能酶标仪（ASP300，Thermo），全自动脱水机（TP1020，Leica），组织切片机（RM2235，Leiea），光学显微镜（BX53，Olymplus），Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics）。

1.3 分组与造模 1）分组：采用随机数字表法，32只SD大鼠分为对照组、AR模型组、玉蝉卫肺丸组、氯雷他定组，每组8只。2）造模：除对照组外，其余各组按照文献方法制备AR大鼠模型：致敏阶段给予大鼠腹腔注射卵清蛋白+抗原佐剂混悬液［0.3 mg OVA和30 mg Al（OH）3］溶于1 mL 0.9%氯化钠溶液，隔日1次，共14 d。激发阶段从第15天开始，双侧10% OVA生理盐水溶液滴鼻，每侧50 μL，连续滴鼻7 d。鼻腔激发后30 min内，观察大鼠喷嚏个数、流涕分泌量及搔鼻次数，采用叠加量化法记录评分，当评分≥6时，表明造模成功［5-6］。

1.4 干预方法 造模成功后，根据体表面积法换算，玉蝉卫肺丸组剂量500 μg/kg，中药溶于蒸馏水灌胃，每日1次，氯雷他定组剂量1.25 mg/kg，每日1次，对照组及AR模型组等量生理盐水灌胃，连续用药10 d。

1.5 标本采集与检测 1）Wright染色检测鼻腔分泌物嗜酸性粒细胞：鼻腔分泌物涂片，95%乙醇固定，蒸馏水洗后平放于染色盒内，滴加Wright染色液覆盖涂片上细胞区域，再滴加等量缓冲液，轻轻摇动涂片充分混匀，镜下观察染色情况，适时蒸馏水冲洗终止反应，再经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后备检。200倍镜下观察并统计嗜酸性粒细胞个数。2）ELISA检测血清IgE水平：末次用药24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，1 400g离心10 min，分离血清，根据ELISA试剂盒说明书步骤检测血清IgE水平。3）HE染色检测鼻黏膜组织形态学改变：处死大鼠，统一取左鼻黏膜组织10%中性甲醛固定，右鼻黏膜组织冻存。组织固定后，常规脱水、包埋、切片，HE染色，显微镜下观察各组鼻黏膜组织病理改变。4）免疫组化检测鼻黏膜组织内肥大细胞的表达：石蜡切片制作为4 μm厚度，脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压热修复3 min，10% H2O2室温封闭10 min，PBS洗涤后加入一抗MC，浓度为1∶200，用PBS代替一抗做阴性对照，4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，镜下DAB显色、苏木精复染、梯度酒精脱水、封片。在光学显微镜200倍下，每切片选取3个高倍视野，拍摄鼻黏膜组织图像。医学图像分析软件（Image Pro-plus6.0）分析测定每张图像的积分光密度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示。两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞及血清IgE水平比较 见表1。Wright染色检测中，嗜酸性粒细胞被染为红色，其细胞质内可见多量紫红色嗜酸性颗粒样物质。与对照组比较，AR模型组大鼠鼻腔分泌物内嗜酸性粒细胞数量增多，血清IgE水平增高（P＜0.05）。各用药组与AR模型组比较，两指标均有下调（P＜0.05），其中玉蝉卫肺丸组嗜酸性粒细胞减少较明显。

表1 各组大鼠鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞及血清IgE水平比较（±s）

表1 各组大鼠鼻黏膜组织嗜酸性粒细胞及血清IgE水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与AR模型组比较，△P＜0.05

组别对照组AR模型组玉蝉卫肺丸组氯雷他定组n 8 8 8 8 EOS（个）3.51±1.07 14.24±3.55*8.02±1.68△9.44±2.24 IgE（μg/mL）40.26±5.61 98.46±11.04*69.72±7.05△73.83±7.96△

2.2 各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察 见图1。光镜下，空白组鼻黏膜上皮未见损伤，假复层柱状纤毛上皮未见变性坏死、增生及萎缩，形态及结构完整，黏膜下层有少数充血，未见炎症细胞浸润及腺体增生。模型组鼻黏膜假复层柱状纤毛上皮明显增厚，杯状细胞增多，黏膜下腺体增生扩张，排列紊乱，黏膜下间质大量炎症细胞浸润、毛细血管明显扩张充血。玉蝉卫肺丸组较模型组大鼠鼻黏膜上皮损伤程度明显减轻，上皮层次较清楚，黏膜下腺体增生不明显，毛细血管扩张充血，水肿不明显，少量炎细胞浸润。氯雷他定组鼻黏膜破损减轻，上皮层次较清楚，黏膜下层腺体轻度减少，毛细血管扩张充血水肿，少量炎性细胞浸润。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织形态学改变（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞表达 见图2。免疫组化结果显示：肥大细胞胞浆呈黄色至棕黄色阳性颗粒，界限清楚，背景清晰。肥大细胞主要存在于大鼠鼻黏膜组织黏膜及黏膜下层，部分肌层亦见表达，以前二者为主要表达部位。对照组高倍镜（200倍）视野下平均肥大细胞数为（28.60±4.50）个，与对照组比较，AR模型组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞蛋白表达增高，平均肥大细胞数为（59.60±8.80）个（P＜0.05）；各用药组与AR模型组比较，肥大细胞数均有不同程度的下调，玉蝉卫肺丸组为（44.80±6.10）个（P＜0.05），氯雷他定组为（48.10±5.30）个（P＜0.05）。

图2 各组大鼠鼻黏膜组织内肥大细胞表达（免疫组化染色，200倍）

3 讨 论

AR为非感染性的免疫炎症疾病，流行病学调查显示，全球40%的人口有AR相关症状，已成为全球性的健康问题［7］。近年来我国AR患病率急剧上升，标准化患病率从2005年的11.1%上升到2011年的17.6%［8］。

变应性鼻炎属于Ⅰ型变态反应，机体在外界抗原的刺激下，诱导鼻黏膜或者局部淋巴组织产生过多的IgE，可与相应细胞（主要为肥大细胞）表面的IgE受体结合，活化肥大细胞分泌组胺或白三烯等炎性介质。这些炎症介质诱导黏膜上皮细胞或者血管内皮细胞分泌细胞因子、趋化分子及黏附分子，不仅造成炎症的进一步加剧，而且还可以趋化募集并活化嗜酸粒细胞及Th2细胞［9］。最新的研究发现，肥大细胞在AR的发生发展过程中不仅仅是分泌炎症介质的“效应剂”，它与鼻黏膜上皮细胞［10］以及神经细胞［11］可存在交互作用，在调节上皮细胞完整性及神经敏感性方面都发挥相关作用。因此，血清IgE水平、嗜酸粒细胞及肥大细胞数量均为衡量AR严重程度的关键指标。笔者实验显示：玉蝉卫肺丸和氯雷他定能显著降低AR大鼠血清IgE水平，抑制嗜酸粒细胞及肥大细胞的活化与增生；同时发现，玉蝉卫肺丸组在降低AR大鼠嗜酸粒细胞及肥大细胞数量方面优于氯雷他定组。

AR主要病理变化为黏膜上皮变性、损伤，黏膜下腺体增生，毛细血管扩张、出血、水肿，神经纤维增生活化及间质炎症等［12］。其中，上皮、血管及神经病变是造成鼻塞、鼻痒及流涕的病理基础，而反复炎症及修复的过程会刺激鼻腔黏膜发生鼻息肉、鼻窦炎。本次实验发现，玉蝉卫肺丸可以修复鼻黏膜上皮损伤，减缓黏膜下腺体及血管增生，减少水肿，控制炎症，有效改善鼻黏膜组织损伤，纠正疾病状态。

AR在中医学属于“鼻鼽”范畴，多数学者认为鼻鼽的发生因虚致病者为多，内因多为脏腑功能失调，外因寒邪和异气之邪为其诱发因素，主要与肺、脾、肾诸脏有关。玉蝉卫肺丸经过中国中医科学院西苑医院耳鼻喉科几代人的临床验证，取得了较好疗效，得到广大患者认可。其成分为黄芪、玉竹、蝉蜕、防风、白蒺藜、辛夷、白芷等。方中君药为黄芪、玉竹，臣药为蝉蜕、防风，黄芪、玉竹有补益肺脾，提高机体免疫力的作用，蝉蜕、防风、蒺藜可疏散风邪、息风止痉，有抑制免疫与抗过敏作用，全方可改善脏腑功能，外散风邪［13-14］。

综上所述，玉蝉卫肺丸可以减轻AR大鼠鼻黏膜组织破坏，降低血清IgE水平，减少嗜酸粒细胞及肥大细胞的趋化，显著改善AR大鼠的炎症及损伤，初步证明了其对肥大细胞和嗜酸性粒细胞有广谱抑制活性，可认为其是抵抗抗原诱导的气道炎症反应的有效保护剂。本研究提供了玉蝉卫肺丸针对AR西医学的病因治疗的理论基础。但在AR研究方面仍有许多值得研究的领域，如中药改善鼻黏膜组织损伤的具体分子机制，抑制肥大细胞活化的作用方式？肥大细胞与鼻黏膜上皮之间是否存在交互作用？这些具体的作用机制还需要我们做进一步的深入研究。