刘敏锋，吴明煜，吴长春，吴昊宇，柯文山

(1.湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉 430062； 2.湖北轻工职业技术学院， 湖北 武汉 430070)

0 引言

湖北钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主[1]，因此控制中间宿主湖北钉螺也是控制血吸虫病的一个重要环节.目前普遍采用的化学方法效果好，但存在水体污染和对水生动物毒害作用难以克服的缺点.因此，科学工作者试图从生殖角度来控制钉螺的繁衍，而这需要快速找到识别钉螺雌雄的方法.1958年丁若望等“利用光照鉴别钉螺雌雄的方法”其正确率是80%左右[2]；且其方法介绍不清晰、用时长,误差大.因此本研究试图从实践中找到快速鉴别钉螺雌雄性的方法，提高鉴别雌雄的正确率且缩短鉴别时间.快速掌握识别钉螺雌雄的方法，为研究钉螺繁殖方面[3]、钉螺种群动态统计[4]、雌雄交配对策和性信息素[5]、控制钉螺种群等提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料钉螺：于2019年9月分别采自湖北省荆州市、黄石市和四川省，经逸蚴法鉴定为阴性[6]，选择活动性好的成螺用于实验.实验用的荆州钉螺，其成螺大小一般在8.64 mm×3.49 mm～9.73 mm×4.24 mm之间.黄石市成螺大小在7.54 mm×3.13 mm～7.87 mm×3.20 mm之间.四川省成螺大小在5.80 mm×2.71 mm～6.03 mm×2.85 mm之间.采回后反复用去离子水清洗，去除泥沙，剔除阳性螺和死亡螺，用实验室自制的瓦钵法[5]饲养钉螺.瓦钵直径为16 cm,高13 cm,底为1.5 cm.然后将经过高温灭菌(121 ℃，20 min)并过筛(60目)的厚泥浆倒入钵底，泥浆厚度为2 cm.若泥浆干后出现裂缝时，压平缝隙，钵口用纱罩封盖.将瓦钵放在白色搪瓷盘中，盘中加入一定量的纯水，保持一定的湿度.将瓦钵放置在室温中，每天喂食3次硅藻营养液，温度保持在(25±2) ℃以下，每天光照10 h.实验前挑选活性强的成螺，置于烧杯中，用去离子水清洗3次，准备待用.

1.2 研究方法将钉螺放入培养皿中，将培养皿置于奥林巴斯解剖显微镜下，打开光源系统照明，用Nikon D5200单反相机拍摄钉螺的各体位图.

1.3 钉螺的雌雄鉴别

1.3.1 鉴别工具 奥林巴斯解剖显微镜、培养皿、手电筒、放大镜、镊子、毛刷等.

1.3.2 室内鉴别 从野外采回的钉螺放在瓦钵中饲养3 d，每天加3次营养液[7]，维持正常的生命所需.

1)用纯水多次清洗钉螺表面的泥土，并用软毛刷轻轻刷钉螺的壳体以去除钉螺身上的污渍和藻类.

2)将清洗干净的钉螺放入9 cm的培养皿中，加适量的水淹没钉螺[8]，将培养皿放置于解剖镜下.

3)将解剖显微镜底部的光源打开，刺激钉螺头足部伸出.

4)优先选取其头部和触角伸出的钉螺，用镊子夹住钉螺使其螺口朝左[9]，整个螺体位倾斜向右，观察钉螺头部与螺壳空隙.

1.3.3 室外鉴别方法

1) 将采集到的钉螺洗去螺壳上的污泥及藻类，以便观察.

2) 清洗干净的钉螺放在直径为9 cm的滤纸上，用镊子夹住钉螺使其螺口朝左，整个螺体位倾斜向右.

3) 借助太阳光或阴天使用手电筒，用放大镜透过螺壳观察钉螺头部与螺壳空隙.

2 雌雄鉴别结果

2.1 室内鉴别的结果用纯水清洗干净的钉螺，优先选取其头部和触角伸出的钉螺，用镊子夹住钉螺使其螺口朝左，整个螺体位倾斜向右，观察钉螺头部与螺壳空隙.钉螺对光照十分敏感，在光照条件下，钉螺会慢慢将厣打开，头部伸出，触角位于头部背方的两侧和头颈之间，是一对细长的突出，能伸缩运动.在奥林巴斯解剖显微镜下钉螺头部与螺壳空隙可观察到粉红色或肉突的阴茎(如图1、图2、图3、图5)，因此可以辨别出雄性钉螺，反之，则是雌性钉螺(图4、图6). 钉螺厣的闭合程度情况不一样[11-12]，所以图2与图1雄性钉螺交配器所在位置也随之发生改变. 观察时用镊子夹住螺体轻轻顺时针旋转，旋转一周后找到粉红色的阴茎则是雄螺，若没有找到粉红色的阴茎则是雌螺[10].图5是四川钉螺，属于山丘型钉螺，个体大小偏小，雄性阴茎也偏小，图6则没有观察到粉红色的肉突，则为雌性.

本室内鉴别方法从2019年5—8月，每个月一批，每批100只钉螺，每个月分3次检验，减少误差，来确保在不同季节、不同时间段鉴别方法的正确性，每批螺在45 min内可鉴别完成.鉴别正确率从5月份的92.60%到6月份的97.68%，最后7—8月份正确率均达100%，平均每个螺被成功鉴别的时间大约在30 s之内完成.

图1 湖北黄石雄性钉螺

图2 湖北荆州雄性钉螺

图3 湖北荆州雄螺交配器位于体螺层右侧

图4 湖北荆州雌性钉螺

图5 四川雄性钉螺

图6 四川雌性钉螺

2.2 野外鉴别结果清洗干净的钉螺，优先选取其头部和触角伸出的钉螺，用镊子夹住钉螺使其螺口朝左，整个螺体位倾斜向右，观察钉螺头部与螺壳空隙.钉螺对光照十分敏感，在太阳光或者手电筒的光照条件下，钉螺会慢慢将厣打开，头部伸出，触角位于头部背方的两侧和头颈之间，是一对细长的突出，能伸缩运动.在钉螺头部与螺壳空隙可观察到粉红色的阴茎，因此可以辨别出雄性钉螺，反之，则是雌性钉螺.根据螺厣闭合程度不同，雄性钉螺交配器所在位置也随之发生改变，如用镊子将螺体旋转一周观察不到此结构，则为雌螺.

2019年5月至10月，每月一批，每批鉴别100只钉螺，每次鉴别均可在60 min内完成，平均每个螺被成功鉴别时间的大约在40 s内完成，经过室内复检正确率达到93.83%.

2.3 钉螺鉴定复查表我们对湖北荆州钉螺进行了野外鉴别及室内复查，具体结果见表1和表2.

表1 湖北荆州钉螺野外鉴别及室内复查

表2 湖北荆州钉螺室内鉴别统计表

3 小结与讨论

野外鉴别时，洗净钉螺，在阳光下或借助手电筒，并旋转钉螺，寻找并确认雄螺阴茎，钉螺雌雄检出正确率超过90%，平均达93.83%(表1)，较前人的检出率(80%)[2]大大提高.室内检出时，从摸索阶段的92%(如5月)到熟练时检出正确率为100%(如7—8月份)(表2).野外检测时，由于某些钉螺壳体表面模糊、钉螺的厣向内收缩幅度大、雄螺的阴茎从外壳上不易观察，有少量雄螺不易检出.而室内在解剖显微镜的光源刺激下，钉螺头足伸出，野外不易鉴别的雄螺在此时可清晰鉴别.而容易观察的钉螺可以直接从螺外观察到雄螺阴茎交配器如图1、2、3、5.因此，野外不确定钉螺通过室内观察法加以纠正.

丁若望等(1958)虽然也利用光照鉴别钉螺雌雄的方法，但其报道的正确率是80%左右[2]，吴海萍[10]等方法介绍不清晰、误差大，也没有统计鉴别时长.我们在前人基础上加以改进，通过应用对钉螺为期4个月(5—8月)，雌雄鉴别摸索，逐渐熟练掌握鉴别方法，大大提高了鉴定的准确率.我们在室内45 min内100只湖北荆州钉螺鉴别的正确率从5月份的92.60%到6月份的97.68%，最后7—8月的检测正确率达100%，平均每个钉螺被成功鉴别的时间大约在30 s之内完成.在室外60 min内100只钉螺鉴别的正确率达93.83%，平均每个钉螺被成功鉴别大约在40 s内完成，不但正确率高，且检测时间短.因此此方法不失为快速、简单、准确辨别钉螺雌雄的方法.

尽管我们建立了一种快速鉴别雌雄钉螺的方法，但仍然有许多问题需要进一步解决.譬如，在钉螺的雌雄鉴别中，肋壳钉螺螺纹增加了观察的难度[13]，即使是熟练者也是有一定的误差.不同地区生长的环境不一样[14-15]，钉螺壳上附有许多影响观察的物质，如污泥、难以清洗的杂质和藻类等，也同样影响观察者的鉴定.如果在阴天光线暗误差可能会更大，在野外清洗不彻底，耗时比较长，影响工作的效率.不同地区钉螺的大小不一样、肋壳钉螺和光壳钉螺的螺纹不一样，为快速正确鉴定钉螺带来一定难度，因此如何快速准确鉴别雌雄还需进一步探索.