龚晓平 况晓明 罗挺 李加胜 莫春红 何焕然 赵许兵 余伟 张致力

摘要 [目的]對低温胁迫下苗期水稻（Oryza sativa L.）进行耐冷性生理学和形态学鉴定，为耐冷相关基因定位和克隆奠定基础。[方法]以耐冷籼稻材料P1211和冷敏型籼稻突变体cisc（ta）为试验材料，于苗期在人工气候箱中进行低温胁迫处理（12 ℃），以适温处理（25 ℃）的参试材料作为对照，研究低温胁迫对水稻冷敏感突变体cisc（ta）苗期抗氧化系统和氨基酸积累的影响。[结果]与适温处理相比，P1211和cisc（ta）在低温下幼苗株高、冠鲜重、冠干重、最长根长、根鲜重、根干重显著下降;同时叶片抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT），可溶性蛋白，光合色素含量不同程度降低，冷敏型籼稻突变体cisc（ta）幼苗的降幅大于耐冷籼稻材料P1211;此外，在长期低温胁迫下，突变体cisc（ta）叶片丙二醛含量极显著增加，而P1211无显著差异。低温胁迫后P1211和突变体cisc（ta）的脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸含量极显著增加，而亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的含量极显著降低，其中突变体cisc（ta）精氨酸的含量增幅最大。恢复正常处理后，突变体cisc（ta）叶片光合色素含量恢复到正常（CK）水平，但株高显著变矮，成熟期结实率和产量降低。[结论]低温胁迫处理影响突变体cisc（ta）幼苗生长特性，降低了叶片抗氧化酶活性，提高了脯氨酸和游离氨基酸的含量。该研究加深了对水稻苗期耐冷性生理基础的全面认识，并为相关基因的克隆及水稻耐冷分子育种奠定基础。

关键词 水稻;低温胁迫;耐冷性;抗氧化系统;游离氨基酸

中图分类号 S511  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）24-0055-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.013

Effects of Low Temperature Stress on Antioxidant System and Amino Acid Accumulation of Rice Mutant cisc （ta） at Seedling Stage

GONG Xiao-ping，KUANG Xiao-ming，LUO Ting et al （Yudongnan Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 408000）

Abstract [Objective]To identify the physiological and morphological of cold tolerance of rice （Oryza sative L.）at seedling stage under low temperature stress，so as to lay a foundation for the localization and cloning of cold tolerance related genes.[Method] Using cold-tolerant indica rice material P1211 and cold-sensitive indica rice mutant cisc（ta） as test materials，low-temperature stress treatment （12 ℃） was carried out in an artificial climate incubator at the seedling stage，and suitable temperature treatment （25 ℃） was used as the test material.The test materials were used as controls to study the effects of low temperature stress on the antioxidant system and amino acid accumulation in the seedling stage of the cold-sensitive mutant cisc（ta） of rice.[Result]Compared with the suitable temperature treatment，the seedling height，shoot fresh weight，shoot dry weight，longest root length，root fresh weight and root dry weight of P1211 and cisc（ta） were significantly reduced under low temperature;at the same time，the activities of antioxidant enzymes （SOD，POD，CAT），soluble protein and photosynthetic pigment in leaves decreased in varying degrees.The decline of cold sensitive indica rice mutant cisc（ta） seedlings was greater than that of cold tolerant indica rice material P1211;in addition，under long-term low temperature stress，the content of malondialdehyde in leaves of mutant cisc（ta） increased significantly，but there was no significant difference in P1211.After low temperature stress，the contents of proline，arginine，aspartate，glutamate and lysine in P1211 and mutant cisc（ta） increased significantly，while the contents of leucine，methionine and isoleucine decreased significantly.The content of arginine experienced the biggest growth in the cisc（ta） mutant.After the normal treatment was restored，the photosynthetic pigment content of the mutant cisc（ta） leaves returned to the normal （CK） level，but the plant height was significantly shorter，and the seed setting rate and yield at the maturity stage were reduced.[Conclusion]Low temperature stress treatment affected the growth characteristics of mutant cisc（ta） seedlings，reduced leaf antioxidant enzyme activities，and increased the contents of proline and free amino acids.This study deepened the comprehensive understanding of the physiological basis of rice cold tolerance at seedling stage，and laid a foundation for the cloning of related genes and rice cold tolerance molecular breeding.

Key words Rice;Low temperature stress;Cold tolerance;Antioxidative systems;Free amino acid

基金项目 重庆市基础研究与前沿探索项目（cstc2018jcyjAX0447）。

作者简介 龚晓平（1980—），男，重庆垫江人，副研究员，博士，从事水稻遗传育种、分子生物学研究。*通信作者，研究员，主要从事水稻遗传育种研究。

收稿日期 2021-04-11

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的禾谷类作物，也是超过50%人口的主要粮食。需要培育具有高产潜力和对逆境胁迫具有强且持久抗性的品种，以满足人们对水稻的需求。水稻起源于热带/亚热带地区，因此对低温胁迫非常敏感，低温冷害对水稻造成多种损害，包括种子发芽不良、幼苗失绿白化或枯萎、分蘖减少、孕穗期不育以及抽穗开花期颖壳不张开、花药不开裂、花粉不发育而造成不育[1-3]。因此，低温冷害是限制水稻产量和种植面积扩大的世界性问题。近年来，直播水稻因成本低、操作简洁而在世界范围内得到广泛应用。然而，将预发芽种子直接播种在冷水田里很容易受到冷胁迫的影响，提高水稻在萌发期和芽期的耐冷性成为直播水稻品种选育过程中的主要难题。因此，鉴定水稻耐冷性相关基因，深入了解水稻对冷胁迫的反应机制，将有助于水稻耐寒性的遗传改良。

植物在冷胁迫下会发生许多生理变化，包括对细胞膜的直接和间接损伤。冷胁迫可以使细胞膜受到损伤，引起电解质渗漏，同时破坏细胞环境，導致细胞器功能下降[4-5]。光系统II （PSII）被认为是与逆境胁迫或衰老相关的光合作用元件损伤的主要部位[6]，而冷胁迫下PSII损伤可引起叶绿素荧光强度的变化。低温胁迫导致亚细胞内活性氧（ROS，如H2O2、O2-和HO-）的积累[7]。这些过多的活性氧在低温下不仅破坏细胞膜和叶绿体结构，抑制光合作用和叶绿素荧光，而且会导致蛋白质、DNA和脂类的氧化损伤，进一步导致细胞功能受损甚至植株死亡[8]。丙二醛（MDA）是磷脂中不饱和脂肪酸过氧化的产物，是导致冷胁迫下细胞膜损伤的主要原因[9-10]。植物已经建立了利用防御酶提高抗寒能力的高效活性氧清除体系，防御酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT），这些防御酶在植物细胞中对ROS的积累起积极的抑制作用[11]。同时，植物也可以通过增加可溶性蛋白、可溶性糖、游离氨基酸和脱落酸（ABA）等渗透物质的含量来减少冷胁迫造成的损害[12-13]。游离氨基酸具有很强的亲和性，能增加细胞液的浓度，对原生质的保水能力及胶体稳定性有一定作用[14]，游离氨基酸中的脯氨酸广泛参与渗透调节、碳氮代谢，保护多数酶类物质，增强植物抗低温胁迫能力[15]。

水稻苗期耐冷性形态学和生理学的准确鉴定是耐冷相关基因定位和克隆的基础。该研究以耐冷籼稻材料P1211和冷敏型籼稻突变体cisc（ta）为试验材料，进行低温胁迫处理，检测其表型特征、抗氧化生理指标和氨基酸积累的差异。深入分析冷敏型籼稻突变体cisc（ta）幼苗在低温胁迫下的生长变化和生理特性，为鉴定和分离出水稻耐冷胁迫潜在的候选基因，并全面、深入了解水稻耐冷性的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 突变体cisc（ta）是在重庆渝东南农业科学院开展水稻育种过程中发现的1个苗期低温失绿突变体，材料命名为cisc（ta）（cold-induced seedling chlorosis）。经连续多代自交得到纯合的稳定遗传株系。籼稻材料P1211和突变体cisc（ta）的秧苗经低温胁迫处理后进行表型特征观察和相关生理指标测定，均以适温（25 ℃）处理条件下的P1211和突变体cisc（ta）为对照。

1.2 低温胁迫处理 各选取P1211与突变体cisc（ta）籽粒饱满的种子进行浸种、催芽，将萌发一致的芽谷分别播种于8 个塑料盘中，置于人工气候箱中，在28 ℃/ 25 ℃，14 h/10 h 光暗交替培养，植株生长到三叶期时，将其分别置于低温（恒温12 ℃）和适温（恒温25 ℃）的人工气候箱，光照强度为180 μmol /（m2·s），光照12 h和黑暗12 h，处理7 d后，测定幼苗生长状况和耐冷相关生理指标。低温处理后的突变体cisc（ta）经适温恢复14 d后大田移栽，测定苗期经过低温（12 ℃）胁迫处理和适温（25 ℃）处理的cisc（ta）CK在分蘖期和抽穗期叶绿素含量以及成熟期的农艺性状。

1.3 幼苗生长状况调查 低温胁迫后，取10 株幼苗进行株高、单株总根数、最长根长的测量;取100 株幼苗，将根与地上部分开，吸干表面水分后称量根和冠鲜重，然后在恒温烘干箱80 ℃烘干，冷却后称量根和冠干重。

1.4 生理性状测定 在苗期，采集12和25 ℃条件下的P1211和突变体cisc（ta）的叶片，放入采样袋，-20 ℃冰箱保存备用。叶绿素含量采用分光光度法测定[16]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法测定[17]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[18]，过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外分光光度法测定[19]，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定[20]，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用淡蓝四唑法测定[21]，游离氨基酸（脯氨酸、亮氨酸等）含量采用酸性茚三酮法测定[22]。

2 结果与分析

2.1 低温对P1211和突变体cisc（ta）幼苗植株形态的影响 经低温胁迫处理（12 ℃）后，突变体cisc（ta）幼苗地上部分（株高、冠鲜重、冠干重）和地下部分（总根数、最长根长、根鲜重和根干重）各形态指标均显著降低，且各指标的降幅均大于P1211;低温胁迫下，P1211的地上部分和地下部分指标除总根数外，其余指标均有显著降低（表1）。低温胁迫处理对水稻幼苗地上部和地下部生长都产生了不利影响，且对突变体cisc（ta）的影响大于P1211，表明P1211的耐冷性显著强于突变体cisc（ta）。

2.2 P1211和突变体cisc（ta）苗期低温处理后叶片抗氧化生理性状比较 经低温胁迫处理后，P1211和突变体cisc（ta）的氧化酶活性（SOD、POD、CAT），光合色素和可溶性蛋白含量不同程度降低，且突变体cisc（ta）的降幅远大于耐冷材料P1211（表2），表明低温胁迫后突变体cisc（ta）清除超氧阴离子的能力严重下降，使得过氧化氢在植株内积累，通过代谢过程将多余的氧气转化为对植株有毒的活性氧（ROS），导致叶片叶绿体结构受到破坏、光合作用能力减弱。同时，突变体cisc（ta）的MDA含量极显著增加，而P1211的MDA含量與对照间无显著差异，表明突变体cisc（ta）在低温胁迫后膜脂过氧化，造成生物膜损伤，引起磷脂中不饱和脂肪酸过氧化产物MDA的极显著增加，低温胁迫下P1211的抗氧化防御系统清除ROS的能力明显强于突变体cisc（ta）。

2.3 P1211和突变体cisc（ta）苗期低温处理后叶片游离氨基酸含量比较 经低温胁迫后，植物细胞可以通过积累脯氨酸等渗透调节物质来减少或消除低温损伤，增强其耐冷性[23]。在该研究中，经过低温处理（12℃）后，P1211和突变体cisc（ta）叶片的脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）极显著增加，亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）的含量极显著降低，突变体cisc（ta）积累Pro含量明显比P1211要多，同时突变体cisc（ta）在低温胁迫处理（12 ℃）后Arg的含量相当于适温处理（25 ℃）下的6.48倍（表3），表明可能是由于突变体cisc（ta）耐冷性功能基因缺失导致产生了过多的Arg。

2.4 苗期低温胁迫处理对突变体cisc（ta）生长发育及农艺性状的影响 在苗期，低温胁迫处理后大田观测突变体cisc（ta）叶片呈白色，光合色素含量极显著低于适温（25 ℃）处理条件下的cisc（ta） CK，将低温处理后的植株移栽至大田，苗期、分蘖期和抽穗期的观察结果发现，突变体cisc（ta）叶片逐渐从白色转为绿色，光合色素含量逐渐恢复到正常水平，但株高显著变矮（图1）。成熟期，突变体cisc（ta）的株高、每穗总粒数、一次枝梗数、二次枝梗数和结实率分别为对照的95.51%、68.92%、79.41%、68.75%和93.51%（表4）。突变体cisc（ta）的一次枝梗数和二次枝梗数极显著减少，导致其每穗总粒数显著减少。

3 结论与讨论

当植物遭受低温胁迫时，能够通过信号传导使其体内在分子、细胞、生理和生化水平上进行相应调整，及时产生一系列的刺激应答以抵御和适应低温胁迫[9]。当植物完整的叶绿体发育受到长期低温胁迫后会严重破坏其叶绿体的微观结构和光合代谢，抑制光合色素的生物合成，最终导致叶片颜色的差异甚至植物死亡[24]。植物叶片的叶绿素含量高低和叶绿素荧光参数大小通常被作为判断植物耐受逆境胁迫的重要指标[25]。该研究中，P1211和突变体cisc（ta）在低温胁迫后幼苗株高、冠鲜重、冠干重、最长根长、根鲜重、根干重极显著下降，突变体cisc（ta）的降幅大于P1211，表明P1211的耐冷性显著强于突变体cisc（ta）。将低温处理后的突变体cisc（ta）恢复正常大田种植，其叶片从白色逐渐转为绿色，光合色素含量逐渐恢复到正常水平。但在成熟期突变体cisc（ta）的一次枝梗数和二次枝梗数显著减少，导致其每穗总粒数的减少，表明由于突变体cisc（ta）苗期耐冷性差，影响其农艺性状及经济性状。

大量的研究表明，在植物正常生长条件下，植物体内活性氧（ROS）的产生和清除处于平衡状态，当植物遭受低温胁迫时，植物体内ROS大量积累，引发膜脂过氧化，从而造成细胞膜系统损伤[26]。ROS 还会促进多聚不饱和脂肪酸降解并产生MDA，导致冷胁迫下细胞膜进一步的损伤[9-10]。植物拥有由抗氧化酶系统和非酶小分子抗氧化剂组成的抗氧化防御系统来清除ROS，从而减轻 ROS 对细胞的伤害[27]。该研究中，经低温胁迫处理后，P1211和突变体cisc（ta）的氧化酶活性（SOD、POD、CAT），光合色素和可溶性蛋白含量降低，且突变体cisc（ta）的降幅远大于耐冷材料P1211，表明低温胁迫后突变体cisc（ta）叶片中的氧化酶活性（SOD、CAT）极显著降低后，不能充分将超氧阴离子和过氧化氢变成水和氧分子，同时，过氧化物酶（POD）活性极显著降低也减弱了POD以酚类化合物为底物分解H2O2的能力，使得H2O2在植株内积累，通过代谢过程将多余的氧气（O2）转化为对植株有毒的活性氧（ROS），进而导致叶片叶绿体结构受到破坏、光合作用能力减弱。此外，低温胁迫下突变体cisc（ta）的MDA含量极显著增加，表明突变体cisc（ta）在低温胁迫后膜脂过氧化，造成生物膜损伤，引起磷脂中不饱和脂肪酸过氧化产物MDA的极显著增加。该结果为低温胁迫下突变体cisc（ta）的基因功能及表达谱分析奠定基础。

游离氨基酸具有很强的亲和性，能增加细胞液的浓度，对原生质的保水能力及胶体稳定性有一定作用[14]。在持续低温下，植物体中脯氨酸能够清除低温逆境反应产生的过量氢离子（H+），维持细胞质中有氧呼吸的最佳pH，通过其疏水基团与蛋白质结合来提高蛋白的亲水性，保护低温下多数酶类物质，避免酶变性失活，维持蛋白合成[15]。龚明等[28]研究发现，在长期冷害处理下抗冷性弱的IR24积累脯氨酸含量明显比抗冷性强的青林9号多。在该研究中，经过低温处理后，P1211和突变体cisc（ta）叶片中的Pro、Arg、Asp、Glu、Lys含量极显著增加，Leu、Met、Ile含量极显著降低，突变体cisc（ta）积累脯氨酸含量明显比P1211多，同时突变体cisc（ta）在低温胁迫处理后Arg含量相当于适温处理下的6.48倍，表明可能是由于突变体cisc（ta）耐冷性功能基因缺失导致产生了过多的Arg。突变体cisc（ta）过多的Arg是否与缓解因冷冻脱水造成的渗透胁迫有关，或者作为渗透调节物质来减少或消除低温损伤，还需进一步研究。

该试验结果表明，低温胁迫处理严重影响突变体cisc（ta）幼苗生长特性，降低了叶片抗氧化酶活性，提高了叶片中Pro、Arg、Asp、Glu、Lys的含量，特别是Arg的含量，由于突变体cisc（ta）耐冷性功能基因的缺失，其耐冷性极显著弱于P1211。该研究加深了对水稻苗期耐冷性生理基础的认识，为突变体cisc（ta）耐冷性功能缺失基因的克隆及水稻耐冷机理研究奠定了基础。

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