张超

(河南中医药大学，河南 郑州 450046)

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是由于遗传和环境因素引起的一组以高血糖为特征的临床综合征[1]。是胰岛素缺乏或(和)胰岛素作用障碍等引起的糖类、脂肪和蛋白质等的代谢紊乱，其临床表现为多饮、多尿、多食以及消瘦等[2-3]。目前研究认为，脂肪组织不仅作为储藏能量的人体组织，而且可作为能在机体生命代谢中起关键性作用的组织器官[4]。脂肪组织能够分泌相关因子，并以内分泌、旁分泌等途径参与机体的生理功能，调节糖脂代谢平衡，维持内环境的稳定[5]。因此，本研究拟通过检测血糖(FBG、2hBG、14dBG)、血脂(TG)、胰岛素(INS1、INS2)、脂肪因子(LEP)以及新型脂肪因子(Apelin、vaspin)指标的表达，分析脂肪因子与糖尿病发病的分子机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

雄性普通级Wistar大鼠，3月龄，体质量(200±30)g，由郑州大学医学院动物实验中心提供。饲养条件为一级环境条件下饲养,温度控制在20 ℃～28 ℃,控光(12 h明暗相间),自由饮水、采食。

1.2 药品、试剂及仪器

1.2.1 药品

复脾汤药物组成：人参10 g，黄芪12 g,茯苓12 g，五味子12 g，山药12 g，麦冬10 g，葛根10 g，天花粉10 g，鸡内金12 g，炒麦芽10 g和炒神曲10 g。由河南中医药大学第三附属医院提供药材和代煎，汤剂浓度:相当于生药1 kg/L。二甲双胍(0.5 g/片，批准文号：国药准字H20041986，北京万辉双鹤药业有限责任公限公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)。

1.2.2 试剂

大鼠瘦素(LEP)酶联免疫吸附测定试剂盒(货号：E-EL-R0582c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；大鼠胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒(货号：E-EL-R2466c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；大鼠内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)酶联免疫吸附测定试剂盒(货号：E-EL-R1066c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；大鼠Apelin(APLN)酶联免疫吸附测定试剂盒(货号：E-EL-R2413c，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。

1.2.3 仪器

One Touch强生血糖仪(强生(中国)医疗器材有限公司)；全自动生化分析仪(Chemray型，Rayto公司)；微型高速离心机(C2500-R-230V型，美国Labnet有限公司)；电热恒温培养箱(ICV-450型，日本ASONE有限公司)；全自动酶标仪(Multiskan MK3型，Thermo scientific有限公司)。

2 实验方法

2.1 动物模型的建立

40只Wistar大鼠均适应性喂养2周后，按体质量随机选取10只大鼠作为空白组。空白组继续给予普通饲料喂养。剩余30只大鼠给予高糖、高脂饲料喂养。高糖、高脂饲料喂养4周后禁食，不禁水12 h，称取大鼠体质量。高糖高脂组按35 mg/kg腹腔注射1.75% STZ柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，空白组按同等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。

柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制：取2.1 g柠檬酸加入100 mL双蒸水，配制成0.1 mmol/L A液，取2.94 g柠檬酸钠加入100 mL双蒸水，配制成0.1 mmol/L B液。取28 mL A液与22 mL B液混合，用双蒸水定容至100 mL，用pH试纸测pH值为4.2～4.5，即为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，临用前10 min配制。1.75% STZ柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制：取700 mg STZ 溶于40 mL上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，即可配制成 1.75% STZ柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，现用现配，配制过程防潮，配制后30 min内用完。

STZ注射72 h后，所有大鼠禁食不禁水12 h，20%葡萄糖溶液按照2.0 g/kg剂量灌胃以测 OGTT。断尾法取血，One Touch强生血糖仪分别测该组大鼠空腹血糖(FBG)、OGTT后2 h血糖(2hBG)，酶联免疫法测空腹胰岛素(FINS)。取FBG≥7.8 mmol/L或血糖峰值≥16.7 mmol/L的大鼠为造模成功大鼠。本试验建模存活率为96%,稳定成模率为75%。

2.2 动物分组及给药

将造模成功的大鼠采用高脂、高糖饲料并随机分成复脾汤组10只、二甲双胍组10只、模型组10只和正常组10只。造模2周后进行药物干预，模型组和正常组均用生理盐水(每1 kg体质量10 mL)灌胃；二甲双胍组是用二甲双胍悬浮液按每1 kg体质量0.089 g灌胃；复脾汤组使用复脾汤煎剂，按每1 kg体质量14.2 g的剂量灌胃。

2.3 标本采集

用药6周后，大鼠空腹状态下用麻醉药(20%乌拉坦)进行腹腔麻醉,进行主动脉采血，采用离心机离心(3 000 r/min)20 min后，收取上清液，将上清液存于-80 ℃冰箱，待指标检测。

2.4 指标检测

采用生化法检测FBG、2hBG、14dBG和TG；酶联免疫吸附实验法(Elisa法)检测LEP、INS、vaspin和Apelin指标的表达。

2.5 检测方法

2.5.1 FBG、2hBG、14dBG和TG检测方法

采用全自动生化仪进行检测。

2.5.2 LEP、INS、vaspin和Apelin指标检测方法

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。1)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min。2)弃去孔内液体，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗体工作液100 μL(在使用前20 min内配制)，给酶标板加上覆膜，37 ℃温育1 h。3)弃去液体，洗板3次，每次浸泡30 s，大约350 μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。4)每孔加酶结合物工作液(临用前20 min内配制，避光放置)100 μL，加上覆膜，37 ℃温育30 min。5)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 复脾汤对各组大鼠FBG、2hBG、14dBG和TG的影响

与对照组比较，治疗后复脾汤组和二甲双胍组FBG、2hBG、14dBG和TG指标均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；复脾汤组与二甲双胍组比较，FBG、2hBG、14dBG和TG指标均高于二甲双胍组，两组BG、2hBG、TG指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，14dBG指标比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3.2 复脾汤对各组大鼠INS的影响

与对照组比较，治疗后复脾汤组和二甲双胍组INS1升高，INS2表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与二甲双胍组比较，复脾汤组INS1、INS2变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠INS的变化

3.3 复脾汤对各组大鼠LEP、Apelin、vaspin的影响

与对照组比较，复脾汤组和二甲双胍组LEP、Apelin、vaspin表达均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。从复脾汤组和二甲双胍组LEP、Apelin、vaspin表达情况比较，变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠LEP、Apelin、vaspin的变化

4 讨论

糖尿病属于“消渴”范畴。历代医家对消渴的研究认为，病机以肾阴虚为本，燥热为标，分上、中、下三消论治[6]。消渴的发病虽与肺、脾、肾等多脏器失调相关，但其首发于脾胃，久则影响三焦，脾胃功能的失调是消渴发生、发展的重要因素[7]。脾、胃位中焦，两脏燥湿相济，阴阳相合，升降相因相辅为用。脾胃为后天之本，气血生化之源。脾主运化、升清，胃主受纳、腐熟水谷，共同完成饮食水谷的消化吸收。若脾失健运，郁而化热，则多食易饥[8]。脾虚不能散精，则肺失所养，肺阴不足，津液无以输布则成干渴。脾为胃行其津液，若脾阴不足，胃火亢盛，则多饮多食。糖尿病患者虽多饮多食，但多形态消瘦，究其病因与脾体合肌肉，主四肢的功能失调相关[9]。若脾运失健、肌肉失养而形体消瘦。脾胃虚弱，升清降浊失常，精微随浊阴之气下流而尿量增多，混浊如脂膏、味甜[10]。脾气亏虚，健运失职，“游溢”乏力，是糖尿病血糖升高及诸症萌生的源泉。

复脾汤是根据脾虚“不及游溢”的消渴病基本病机，具有健脾和胃消积养阴之功用。方中多为药食同源之中药，无明显不良反应。方中人参味甘，有大补元气、生津止渴、调荣养卫的功能；黄芪味甘，健脾益气、扶正固本的功效；五味子酸涩，滋肾水、纳元气，既能生津又可涩精的作用；山药甘平，益气养阴、生津止渴，能平补肺、脾、肾三脏之气；麦冬具有生津润肺、养阴清热的功能；葛根升清降浊、有生津化液止渴之功，能促进营津上升，精气布散，鼓舞胃气上行而生阴液；天花粉味甘性凉，养胃阴，泻瘀火，善于清热生津、消肿排脓，乃“消渴圣药”；鸡内金消积滞、健脾胃。该方切合消渴病的基本病机，临床疗效显著。

目前研究认为，糖尿病的发病与胰岛素缺乏或(和)胰岛素作用障碍关系密切相关。胰岛素功能失调会导致糖类、脂肪和蛋白质等代谢紊乱，脂肪组织不再仅仅作为储藏能量的人体组织，而在机体生命代谢也起关键性作用[11]。脂肪组织分泌的多种激素如瘦素、脂联素、抵抗素及细胞因子等，能调节糖脂代谢平衡，维持内环境的稳定[12-15]。因此，本研究认为糖尿病与糖脂代谢失衡关系密切。

瘦素(LEP)是由脂肪细胞分泌的脂肪因子，也是人体自身调节的产物，并且对胰岛素有双向调节作用[16-17]。因此，LEP能调节血糖。Apelin和vaspin为一种新型脂肪因子，在脂肪组织中大量表达。Apelin与糖尿病的发生、发展，以及糖尿病抵抗等方面均有重要作用。目前研究认为，糖尿病患者vaspin指标的升高可能是胰岛素水平降低的一种代偿反应，但其与糖代谢的关系然不明确[18]。本研究通过对STZ模型大鼠LEP、Apelin、vaspin指标检测发现：模型组、复脾汤组和二甲双胍组LEP、Apelin、vaspin指标均升高，与模型组比较，复脾汤组和二甲双胍组均有统计学意义(P<0.05)。

目前研究认为，糖尿病与肥胖的病理基础相同，其疾病的发生与胰岛素抵抗相关。因一些脂肪因子可促进胰岛素抵抗的发展，故成为目前研究的热点。有研究[19]认为，新型脂肪因子(Apelin、vaspin)可增加胰岛素的敏感性。二甲双胍是治疗2型糖尿病的常用药物，有促进胰岛素分泌的作用[20]。因此本研究选用二甲双胍为阳性对照组，结果表明，复脾汤与二甲双胍对STZ模型大鼠均有较好的治疗效果。复脾汤是中药制剂，无二甲双胍恶心、腹部不适、腹泻皮疹、荨麻疹等不良反应。

本研究基于中医基础理论“脾主散精”理论，以“脾虚不及游溢”为切入点，观察具有健脾益气功效的复脾汤对大鼠血糖、TG、INS、LEP及新型脂肪因子Apelin、vaspin血清水平的影响，以探明复脾汤治疗糖尿病的生物学机制,并验证“脾主散精”理论，从而证实糖尿病患者存在“脾气虚”的病理状态，为中医从脾论治糖尿病提供可靠依据。