郑春磊，吕杨俊，朱建红，蒋玉兰，潘俊娴，施昌衍，王孔锡，朱跃进

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016； 2.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016；3.衢州市衢江区检验检测中心，浙江衢州 324022； 4.龙游圣堂茶业专业合作社，浙江衢州 324022；5.瑞安市云顶农业专业合作社，浙江瑞安 325200）

青钱柳（Cylocaryapaliurus （Batal.） Iljinskaja）是我国特有的濒危树种，在降 “三高”、抗氧化、抗菌、抗癌等方面具有显著功效[1-6]，被誉为 “医学界的第三棵树”。 2013 年，国家卫计委将青钱柳叶列为新资源食品[7]，为其开发利用提供新契机。 研究表明，青钱柳多糖是青钱柳的主要功能成分，在青钱柳叶、根、枝、茎等各个部位均有分布，且以叶片中含量最高[8]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节等功能[9-11]。 近年，有关青钱柳多糖的研究主要围绕提取分离（纯化）、功能评价及机制研究、分子修饰、 深加工产品开发等方面，其中提取分离（纯化）是各领域研究开展的基础，亦是当下青钱柳资源深加工开发利用的热点之一。

青钱柳多糖以分子量300 kDa 以上的大分子多糖为主（69.5%），由半乳糖、葡萄糖、 阿拉伯糖、鼠李糖等单糖组成，易溶于水，难溶于有机溶剂[12-15]。 当前，青钱柳多糖的提制主要是在植物多糖提制方法的基础上展开工艺优化，包括提取和分离纯化两个模块。 基于此，文章综述了青钱柳多糖提取分离技术的研究现状，以期为青钱柳多糖的提取分离、开发利用提供依据。

1 青钱柳多糖提取技术

1.1 热水直接浸提

植物多糖的提取技术已相对成熟，一般先采用热水将多糖浸出，进而利用多糖不溶于有机溶剂的性质，加入无水乙醇等有机溶剂沉淀得到粗多糖[16-18]。 青钱柳多糖作为植物多糖的一种，通常也采用水提法进行粗提[19]。 粗提过程主要受提取时间、温度、料液比、次数等因素的影响，因不同植物间多糖的组成及理化特性存在差异，其提取参数也有所不同。

研究表明，青钱柳在水提的条件下，其多糖得率与提取温度（60~100 ℃）、次数（1~3 次）、时间（60~150 min）呈正相关性，与料液比（1∶6~1∶10）呈负相关性，并在较优条件下趋于稳定[15]。 谢建华等[15]研究表明，在90 ℃水浴条件下，影响青钱柳多糖得率的因素顺序为：提取次数＞时间＞料液比，且在优化的工艺条件下（提取次数3 次，时间150 min，料液比1∶8），青钱柳多糖得率达6.54%。陈木森等[14]通过100 ℃水浴提取，正交优化提取时间、料液比、pH 值等参数，结果表明，影响青钱柳多糖得率的因素顺序为： 料液比＞时间＞pH 值，最佳工艺为料液比1∶20，时间7 h，pH 9.0。 此外，热水浸提前，也可通过80%乙醇回流的方法脱除青钱柳叶中单糖、低聚糖、多酚、氨基酸等醇溶性杂质，水提后进一步利用醇沉的方法沉淀获得青钱柳粗多糖[20]。

常规水提法具有操作简单、得率高、设备投入小等优点，是工业化提取植物多糖最为普及的方法，但也存在提取时间长、高温破坏多糖活性、浸提液量大浓缩耗时耗力等缺点。

1.2 辅助提取

为提高热水直接浸提的效率，可通过稀碱处理、酶解、超微粉碎、超声波、微波等技术进行辅助提取[21-23]，利用细胞结构破坏、热效应、机械作用及空化效应等方式提高传质效率，加快可溶性固形物的浸出。

1.2.1 超声、微波辅助提取

上官新晨等[24]利用超声波法辅助提取青钱柳多糖，研究了超声功率、时间、料液比对青钱柳多糖得率的影响，结果表明，超声功率和时间是影响青钱柳多糖得率的关键因素，最佳提取工艺为：时间70 min，功率1200 W，料液比1∶10。 应瑞峰等[25]采用青钱柳超微粉-超声-微波复合法提取多糖，先通过超微粉碎技术对青钱柳进行超微粉碎，提高比表面积，再结合超声-微波技术进一步提高多糖在热水中的浸出率，通过参数优化，青钱柳多糖得率和纯度分别达10.02%、26.11%，不仅将提取时间缩短为20 min，同时显著提高青钱柳多糖得率、纯度及降血糖、抗肿瘤和抗氧化的生物活性。但超声、 微波辅助提取法对设备和工人技术水平等要求较高，目前仍未在青钱柳多糖提取中工业化应用。

1.2.2 酶解辅助提取

微生物发酵（酶解）法亦是破坏植物细胞壁结构、提高多糖浸出率的有效方法。 郑晓杰等[26]公开了一种提取青钱柳多糖的方法，主要通过酶解-乙醇溶液超声-二次酶解的工艺-热水浸提的工艺提取制备青钱柳多糖，第一次酶解是为了去除单糖、双糖、低聚糖、生物碱等杂质，第二次酶解是为了充分释放多糖； 该法所得青钱柳多糖得率可达10.53%。 鲁青等[27]采用微生物发酵法同步提取青钱柳多糖和黄酮，在纤维素酶、半纤维素酶酶解基础上，接种黑曲霉、枯草芽孢杆菌等微生物，通过酶和微生物联合处理破坏青钱柳细胞壁结构，提高了青钱柳多糖和黄酮的提取率。 该法存在发酵提取时间长（2 d），引入微生物菌体、次级代谢产物等新杂质等问题，有待进一步攻克。

1.2.3 其他方法

郑晓杰等[28]发明了一种青钱柳脉冲电场提取装置，该装置包括速冻、 击碎和高压脉冲提取装置，先通过液氮实现青钱柳的速冻，再利用击碎装置将速冻青钱柳击碎，最后采用高压脉冲提取装置达到青钱柳多糖等内含物质的高效提取。 但该装置的具体应用实例未见报道。

2 青钱柳多糖分离纯化技术

粗提制得的青钱柳多糖，多为黑褐色，纯度较低（一般＜30%），需要进一步脱除色素、蛋白质等杂质，进而分离纯化得到较高纯度的多糖。

2.1 脱色

叶绿素、黄酮类、酚类、胡萝卜素、皂苷类等色素是植物多糖的主要杂质之一，影响产品纯度及品质，同时对其定性定量分析和功能作用研究等存在干扰[29]。 植物多糖脱色方法通常有：活性炭法、过氧化氢法、柱层析法、离子交换树脂法、反胶束法等，对于同时含有游离蛋白质和色素的多糖，也可通过生成金属络合物的方法，同时除去蛋白和色素。 其中，活性炭法具有安全、无毒、可再生、易去除、不破坏多糖理化性质等优点，受到广泛应用，但该法脱色率偏低，对脂溶性色素和与糖结合性色素的脱除效果较差； 双氧水法适用于与糖结合性色素的脱除；柱层析法对黄酮类、酚类等色素具有特异吸附脱除的作用。 谢建华等[29]研究表明，活性炭吸附法对青钱柳多糖具有良好的脱色效果，并优化获得最佳工艺条件：温度40 ℃，时间20 min，活性炭用量1.0%，pH 值3.5。 但鲍若晗等[30]的研究表明，青钱柳多糖经过超声铺助提取后（纯度达16.5%），采用活性炭脱色，工艺为活性炭添加量0%~1.4%，脱色时间30~70 min，结果表明该工艺条件下活性炭脱色效果不明显，且对多糖有较大的吸附。

柱层析、 离子交换树脂等方法在青钱柳多糖脱色中的应用常以多糖特异性吸附纯化为目的，双氧水法主要通过氧化降解多糖中的色素类物质达到脱色效果。 谢建华团队[31]研发了一种超声-双氧水结合大孔树脂的青钱柳多糖的脱色方法，该方法采用双氧水法降解色素，并利用超声提高双氧水的脱色效率，再通过AB-8 树脂进一步富集青钱柳多糖，起到双效脱色的作用，脱色率可达80.1%，多糖保留了75.1%。 当前，有关反胶束法在青钱柳多糖脱水中的应用鲜有报道。

2.2 脱蛋白

天然植物多糖与蛋白的分子量相近，且两者常常会形成糖蛋白复合物，因此多糖中蛋白的脱除率较低，往往还伴随多糖的大量损失。 目前，植物多糖脱蛋白常用的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等[32]，前三种方法需要氯仿、正丁醇、三氟三氯乙烷、三氯乙酸等有机溶剂，存在操作人员安全危害、污水处理和环境污染等问题； 酶法脱除蛋白相对温和，但成本高，易引入新的蛋白。 谢建华等[32]对比了Sevage法、三氯乙酸法、盐酸法、酶法（胰蛋白酶）联合Sevage 法等四种经典脱蛋白方法对青钱柳多糖的脱蛋白效果，结果表明，四种方法均造成青钱柳多糖较大的损失，这可能是由于脱蛋白工艺引起多糖与蛋白复合物的损失。 其中，酶解和Sevage 联用法在实现较高蛋白脱除率（47.72%）的同时能获得最高的多糖得率（59.26%），说明此法较其他方法更适合于青钱柳多糖提取液中蛋白质的脱除。

2.3 纯化

经蛋白和色素脱除处理后的多糖通常是不同分子量多糖的混合物，其化学组成、聚合度是不均一、多分散性的，可通过进一步的纯化得到较高纯度的单一多糖。 纯化方法常用有沉淀法、 层析法等，此外，还包括透析法、超速离心法、区域电泳法及膜技术等[33]。

陈木森等[14]利用石油醚将青钱柳叶脱脂脱色，晾干后用水提取，所得滤液经浓缩、Sevage 法脱蛋白、醇沉后，研究不同树脂对青钱柳多糖的静态吸附性能，筛选出一种吸附较好的树脂（D301R），并利用柱层析进行青钱柳多糖的纯化研究。结果表明，D301R 树脂对青钱柳多糖吸附量最大，较优吸附条件为：吸附温度30 ℃，pH7.0，浓度4.0 mg/mL，流速1.5 mL/min；较优洗脱剂为0.4 mol/L NaCl，洗脱率达82.12%。 谢建华等[32]运用Sephacryl-400 葡聚糖凝胶层析柱与大分子纯化系统AKTA Purifier 100 联用对精制后的青钱柳多糖进行纯化，获得一个青钱柳多糖中的主要组分，通过一系列的理化性质研究，表明该多糖为浅黄色粉末，溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。

综上可见，青钱柳多糖的提取分离技术以植物多糖常用的技术为主，且由于青钱柳产业化起步较晚，其工厂化提取分离多为粗提，分离纯化较为少见。

3 展望

多糖是天然植物功能物质研究的热点，其提取分离技术研究已有大量报道，为青钱柳多糖的提取分离奠定夯实的基础。 然而，因青钱柳种子果皮坚硬具有深休眠特性，自然育种率低（0.1%~0.2%）[34-35]，且青钱柳为强阳性树种，幼苗在林荫环境下难以生长[36]，导致青钱柳自然林种群濒临灭绝，被列为国家二级保护树种。 青钱柳资源较为稀缺、 青钱柳叶价格昂贵是青钱柳功能物质提取分离产业化推广的主要难题之一。 为降低青钱柳多糖的提取成本、提高得率，不少学者开始关注青钱柳多糖提取原料的筛选、培育。 上官新晨等[37]采用生物反应器规模化生产青钱柳多糖，几种大量营养素对青钱柳悬浮细胞生长及多糖质量分数影响较大，正交试验结果表明：培养液中添加40 g/L 的蔗 糖、30 mmol/L 总氮、3 mmol/L Mg2+、3 mmol/L Ca2+，较利于青钱柳细胞多糖含量提高（37.95 mg/g）。生物反应器法具有周期短、稳定性强等优点，避免了青钱柳资源匮乏、栽种周期长等问题，将为青钱柳功能成分的提取分离和开发应用提供新出路。