宋燕珂，郭迎雪，孙 莹，李 峣，汪 敏，赵丽艳

(吉林大学第二医院 检验科，吉林 长春130041)

平足蛋白(PDPN)是一种Ⅰ型跨膜黏液型糖蛋白，在多种组织中均有表达，并在个体发育中起着关键作用。近年的研究显示，PDPN在多种恶性肿瘤中表达上调，并且与肿瘤的发生发展及侵袭转移有密切关系，可能成为人类肿瘤治疗的一个新靶点。本文对PDPN在肿瘤侵袭转移过程中的作用和可能机制进行简要综述。

1 概述

PDPN是一种具有大量O-糖苷键的Ⅰ型唾黏蛋白样的跨膜糖蛋白[1-2]。PDPN mRNA首次在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中被鉴定，最初被确定为E11抗原，后因其在肾小球脏层上皮细胞(足细胞)中的低水平表达与足细胞足突的变平有关，而被命名为PDPN[3]。

1.1 PDPN的结构人PDPN由162个氨基酸组成,包括一个高度糖基化的氨基末端胞外结构域、一个高度保守的跨膜结构域和一个短的胞内结构域。胞外区域富含O-糖苷链，存在三个串联重复的保守氨基酸序列(EDxxVTPG)，这一序列被命名为血小板聚集结构域(PLAG)，是PDPN介导血小板聚集和激活的关键基序[2,4]。PDPN的PLAG区域第52位苏氨酸糖基化位点处连接有一个去唾液酸化corel结构，该结构对PDPN的血小板聚集活性至关重要，当该处苏氨酸发生O-糖基化时，PDPN可与血小板表面的C型凝集素样受体2(CLEC-2)结合，从而激活血小板，而该过程不需要血浆的参与[4-5]。PDPN的跨膜结构域含有一个在进化上高度保守的序列(GXXXG)，研究发现，该结构域可介导PDPN在脂筏中的定位及诱导上皮-间质转化(EMT)[2,6]。PDPN的胞内结构域仅含有9个氨基酸，其中前两个近膜氨基酸残基(RK)是PDPN与ERM[埃兹蛋白(ezrin),radixin和膜突蛋白(moesin)]蛋白家族成员中ezrin和moesin结合的主要残基。PDPN与ERM蛋白结合可促进EMT及细胞的迁移和侵袭[7]。此外，PDPN与ERM蛋白的相互作用还能促进一种与癌细胞侵袭有关的特殊细胞表面突起(侵袭性伪足)募集PDPN，并促进侵袭性伪足的稳定[8]。除了基本氨基酸外，PDPN的胞内结构域还含有2个保守的丝氨酸残基(人类蛋白中的S157和S161)，它们可能是蛋白激酶的磷酸化位点。研究发现，磷酸化可以改变PDPN胞内结构域氨基酸的构象，这两种丝氨酸同时磷酸化可抑制细胞迁移[9]。

1.2 PDPN的表达

1.2.1PDPN在正常组织的表达 PDPN在个体发育中起着关键作用，对淋巴系统、肺和心脏等的发育至关重要。在生理状态下，多种正常组织细胞均表达PDPN，如Ⅰ型肺泡细胞、肾脏足细胞、淋巴管内皮细胞、腹膜间皮细胞、骨细胞、成骨细胞和脉络膜丛的室管膜细胞等[1,3,10-11]。胚胎发育期间PDPN激活CLEC-2可促使淋巴管从血液循环系统中分离出来，PDPN缺失的小鼠淋巴管无法从血液系统正常分离，从而出现异常的淋巴管系统[12]。研究表明，PDPN在发育中的神经管中也有表达，其与CLEC-2相互作用影响神经血管的表型，在胚胎发育过程中，PDPN和CLEC-2缺陷的小鼠均表现出神经血管完整性的缺陷[13]。在动物模型中，PDPN表达缺失与足细胞足突的变平、蛋白尿和肾小球选择性通透性降低有关[14]。

1.2.2PDPN在肿瘤组织中的表达及其作用 PDPN在多种肿瘤中表达上调，在不同肿瘤的发生发展中可能起不同的作用。研究表明，PDPN在鳞状细胞癌[10]、胶质母细胞瘤[15]、骨肉瘤[16]、膀胱癌[17]、间皮瘤[18]、精原细胞瘤[19]等肿瘤细胞或(和)癌相关成纤维细胞(CAFs)的表面呈不同程度上调。过表达PDPN与肿瘤进展及侵袭、转移相关，尤其是在乳腺癌[20]、口腔鳞状细胞癌[21]和胶质母细胞瘤[15]等。然而有研究表明，在宫颈鳞状细胞癌[22]、结直肠癌[23]和肺鳞状细胞癌[24]等肿瘤中PDPN的表达可能为良好的预后因素，此外，最近的一项研究表明，细胞膜或细胞质高表达PDPN可能对唇鳞状细胞癌患者的预后有利[25]。MISHIMA等[15]通过组织微阵列(TMA)技术研究发现，PDPN在高级别星形细胞瘤中的表达水平较高，而在低级别星形细胞瘤中的表达水平较低，认为PDPN可能是高级别星型细胞瘤预后的标志物。有研究表明，在高级别胶质瘤中，PDPN在胶质瘤内和胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞中呈高表达，Western blot结果显示PDPN高表达于肿瘤边缘，而非肿瘤核心[26]。在胶质瘤患者中，PDPN的高表达与预后较差有关，并且与瘤内血小板聚集和静脉血栓栓塞(VTE)风险增加有关。在小鼠胶质瘤模型中，使用抗PDPN抗体治疗可抑制肿瘤的生长，提高生存率[27]。

2 PDPN促进肿瘤侵袭、转移及可能的机制

2.1 PDPN与CLEC-2相互作用激活血小板VTE是癌症患者常见的危及生命的并发症，胶质瘤患者在整个疾病过程中发生VTE的风险特别高[28]。一项研究发现，在原发性脑瘤患者(主要是高级别胶质瘤)中，PDPN高表达的肿瘤患者发生VTE的风险约为PDPN阴性肿瘤患者的6倍，说明PDPN与脑肿瘤患者发生VTE密切相关。该研究用Gli16(一种表达PDPN的细胞系)和AMCH(一种不表达PDPN的细胞系)两种不同的胶质母细胞瘤细胞系对人血小板进行体外共培养实验，发现与PDPN阴性的AMCH细胞相比，PDPN阳性的Gli16细胞诱导的血小板聚集明显更高，抗PDPN抗体NZ-1几乎完全降低了Gli16细胞诱导的血小板聚集，而在对照组未观察到这种现象。此外，在与人血小板共培养实验中，PDPN阳性的Gli16细胞诱导血小板释放高水平的血小板因子4(PF4)，该过程可被PDPN抗体NZ-1抑制，而PDPN阴性的AMCH细胞仅轻度释放PF4。这些结果表明，表达PDPN的胶质母细胞瘤细胞系Gli16诱导的血小板聚集是通过PDPN介导的[29]。此外，有研究发现，血小板聚集需要胶质瘤细胞中的PDPN，而不是星形胶质细胞中的PDPN，该研究还发现肿瘤内聚集的血小板位于血管内和肿瘤微环境内，提示血小板可以离开血液循环直接接触肿瘤细胞[30]。

CLEC-2被认为是PDPN的内源性受体，肿瘤细胞表达的PDPN通过与血小板表面的CLEC-2结合，诱导血小板聚集，促进肿瘤的转移[31]。CLEC-2胞内域包含一个YXXL序列，在未受刺激的血小板中，有很大比例的CLEC-2以二聚体的形式存在，并在受到刺激后转化为更高级的结构[32]。当PDPN胞外区域的PLAG结构域第52位苏氨酸被O-糖基化时，PDPN可与血小板表面的CLEC-2结合，结合后的CLEC-2发生二聚化，以酪氨酸激酶(Src)依赖的方式促进YXXL基序中单个保守酪氨酸残基的磷酸化，该酪氨酸的磷酸化启动了与脾酪氨酸激酶(Syk)结合，从而启动信号级联，导致PLCγ和SLP-76的激活,从而诱导血小板聚集，该过程需要钙离子的参与[5,33]。

在肿瘤细胞血行转移中，血管内绝大多数肿瘤细胞会在循环中死亡，它们在到达远处组织的实质之前，就暴露在剪切应力下，并被自然杀伤细胞(NK细胞)清除。目前认为，血小板聚集引起肿瘤细胞的扩散转移可能是通过以下方式：①聚集的血小板可将肿瘤细胞包裹，使肿瘤细胞免受血流剪切力的破坏及免疫细胞的杀伤作用，从而有利于肿瘤的转移；②肿瘤细胞诱导的血小板聚集可能通过促进癌细胞与血管内皮的黏附而促进肿瘤细胞外渗，在机体的第二部位形成转移灶；③激活的血小板可释放许多生长因子，可能促进肿瘤的生长。此外，血小板颗粒的释放也可能影响肿瘤微环境，有助于转移前生态位的形成；④分泌的血管生成因子[如血管内皮生长因子(VEGF)]能够刺激肿瘤血管生成[31,34]。

2.2 PDPN与肿瘤的侵袭和转移

2.2.1PDPN与肿瘤细胞EMT的关系 转移是癌症相关死亡的主要原因，肿瘤细胞EMT是恶性肿瘤发生侵袭转移的重要分子机制。EMT使上皮细胞极性和黏附功能丧失，使静止的上皮细胞能够以单细胞获得迁移特性，伴随特征性的分子标志物的改变如E-钙黏蛋白下调，N-钙黏蛋白和波形蛋白上调[35]。研究发现在MDCK细胞中插入PDPN基因可诱导EMT过程，其可能机制为，PDPN胞内区域中的近膜氨基酸簇可与ERM蛋白结合，两者的结合不仅能够介导PDPN锚定于肌动蛋白细胞骨架，也可激活RhoA，RhoA活性的上调可导致Rock介导的ERM磷酸化，进一步稳定ERM蛋白的活性构象，从而进一步加强PDPN对细胞骨架的锚定，促进EMT及细胞的迁移和侵袭[7,36]。ERM蛋白作为整合膜蛋白和肌动蛋白骨架之间的连接物，磷酸化导致其构象改变，暴露了肌动蛋白和其他蛋白的结合位点[11]。PDPN促进EMT和细胞迁移的另一个必要条件是其与脂筏的联系。PDPN在脂筏中的定位是由跨膜区域的GXXXG基序介导的，该跨膜区域的突变或替换均可导致PDPN无法定位于脂筏，从而阻断PDPN诱导的EMT[2]。此外，有研究表明，PDPN与CD44在侵袭性癌细胞系的细胞突起处协同上调并且相互作用，当PDPN胞外区域发生正确糖基化时，CD44可与PDPN结合，从而促进PDPN诱导的细胞迁移[37]。

2.2.2PDPN可以在不发生EMT的情况下促进肿瘤侵袭 在癌症进展过程中，EMT对于单细胞的侵袭和早期癌细胞的扩散起着至关重要的作用[35]，然而在对Rip1Tag2小鼠β细胞肿瘤的研究发现，PDPN在没有发生EMT的情况下可以促进癌细胞的迁移。在该模型中，PDPN将侵袭模式从单细胞侵袭EMT转变为无EMT的集体侵袭，这些肿瘤细胞表面仍表达E-钙黏蛋白。在分析的临床样本中观察到尽管维持上皮特异性黏附分子，癌细胞仍会侵袭周围组织，因此尽管这些癌细胞有迁移和浸润周围组织的能力，但它们并未受到EMT的影响[38]。

2.2.3PDPN促进细胞外基质(ECM)重构和癌细胞侵袭 为了侵袭和转移，癌细胞必须降解和重塑细胞外基质，包括基底膜和间质基质。基底膜是位于上皮和内皮细胞下的一种致密的、片状的特化类型的ECM，是防止恶性细胞传播的屏障，基底膜断裂和失调是许多恶性肿瘤的特征[39]。

研究表明，PDPN存在于癌细胞表面形成的富含肌动蛋白且具有针对性蛋白水解活性的侵袭性伪足的黏附环中，并促进侵袭性伪足对基质的降解。PDPN募集到侵袭性伪足的黏附环需要与脂筏结合，ERM蛋白在PDPN和肌动蛋白核心周围的肌动蛋白细胞骨架之间起连接作用，介导PDPN定位于侵袭性伪足，而PDPN又可增强侵袭性伪足募集ERM蛋白的能力。功能性研究表明，PDPN通过RhoC-ROCK-LIMK途径调节丝切蛋白(cofilin)的活性促进侵袭性伪足的成熟和稳定，从而促进ECM的有效降解[8]。

在ECM降解过程中基质金属蛋白酶(MMPs)起着重要作用。在侵袭性肿瘤中，PDPN表达与MMPs相关，甚至在肿瘤细胞突起处共定位。已有研究表明，PDPN表达可增强MMP2、MMP14(也称为MT1-MMP)等的表达，从而刺激口腔SCC细胞的侵袭[21]。此外有研究表明基质细胞(尤其是CAFs)也通过MMPs参与癌细胞的转移。PDPN可能激发CAFs破坏和重构肿瘤微环境，使肿瘤细胞沿着CAFs形成的路径迁徙到新的区域[40]。

2.2.4其他 研究表明，PDPN可能促进肿瘤淋巴管的生成，但其具体机制尚未阐明，可能涉及PDPN介导的促淋巴管生成生长因子或细胞因子的分泌如内皮生长因子C(VEGF-C)、内皮生长因子D(VEGF-D)和CCL21等[11]。但SUZUKI等[41]发现肺鳞癌细胞系中PDPN的表达可能通过下调VEGF-C抑制肿瘤淋巴结转移和肿瘤相关淋巴管生成。此外，研究表明，PDPN是外泌体和微囊泡的组成部分，肿瘤细胞和CAFs可将含有蛋白质和mRNA的胞外囊泡分泌到肿瘤微环境中，含有PDPN的外泌体在体外可以刺激淋巴管生成[42]。最近一项研究表明，PDPN可能限制CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)在肿瘤微环境中的生存，从而有利于肿瘤的生长和转移[43]。

3 PDPN在肿瘤治疗中可能的意义

PDPN与肿瘤的发生发展及肿瘤的侵袭、转移有密切关系，可能成为人类肿瘤治疗的一个新靶点。近年研究者正探讨抑制PDPN活性对肿瘤的防治作用。

3.1 以胞外结构域为治疗靶点

3.1.1抑制肿瘤相关血栓形成 抑制血小板活化的药物可以抑制肿瘤的转移，然而针对激活血小板的肿瘤特异性途径即PDPN-CLEC-2轴治疗，可抑制肿瘤转移的同时避免患者术前和术后出血的风险。

相关抗体可被用来破坏PDPN-CLEC-2的相互作用。例如，NZ-1抗体及其衍生物如NZ-8抗体、NZ-12抗体以及其他与PDPN胞外PLAG结构域结合的抗体(如MS-1)[34,44]。研究表明NZ-1抗体能以剂量依赖性的方式抑制胶质瘤细胞相关PDPN引起的血小板聚集[27]。

此外，合成的化合物也被用来阻止PDPN-CLEC-2的相互作用。一种新型的无细胞毒性的5-硝基苯甲酸化合物“2CP”被证明能有效抑制PDPN介导的血小板聚集和肿瘤细胞诱导的血小板活化，并且能在扩大顺铂治疗效果的同时降低出血的风险[45]。

3.1.2靶向治疗 研究表明，当癌细胞表达PDPN时，其糖基化模式似乎发生了改变，这促使了一种抗人PDPN的肿瘤特异性单克隆抗体(CasMab)的产生，LpMab-2与PDPN表达的癌细胞发生反应，但与正常细胞没有反应，因此这种高度特异性的试剂为靶向癌细胞上的PDPN提供了可能[46]。最近有研究表明，chLpMab-2和chLpMab-23均具有抗肿瘤活性[47]。最近一项研究开发了一种新的靶向PDPN的光疗法，该研究将抗PDPN抗体NZ-1与酞菁染料结合，形成一种抗体-光敏剂结合物，利用近红外光免疫疗法(NIR-PIT)，靶向治疗表达PDPN的恶性间皮瘤[48]。

此外，凝集素也可用于靶向转化细胞上的PDPN，如怀槐种子凝集素(MASL)，研究表明MASL可以与PDPN表达相关的方式抑制细胞迁移，可用于对抗口腔鳞状细胞癌和其他表达PDPN的癌症[49]。

3.2 以胞内结构域为治疗靶点如上所述，胞质域的两个丝氨酸同时磷酸化可抑制细胞的迁移，因此可以针对这一点来减少癌细胞的转移。研究表明，蛋白激酶A (PKA)和细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5)可协同磷酸化PDPN的胞内丝氨酸以抑制细胞运动。双硫仑(disulfifiram)和CARP-1功能模拟物等可诱导PDPN磷酸化并抑制PDPN介导的细胞迁移[9]。

3.3 PDPN CAR-T细胞针对PDPN的嵌合抗原受体-T(CAR-T)细胞正被开发用于治疗癌症。最近一项关于胶质母细胞瘤的研究表明，靶向PDPN的CAR-T细胞可减少小鼠脑内原位胶质母细胞瘤[50]。

4 总结

PDPN不仅在个体发育中起着重要作用，还在多种肿瘤中表达上调，并参与多种肿瘤的发展及侵袭、转移，但其在不同肿瘤中发挥不同的作用。PDPN在脑胶质瘤中表达上调，并参与脑胶质瘤患者VTE的形成等过程，与胶质瘤患者的不良预后有关，但其在胶质瘤中的具体作用仍待进一步研究。由于PDPN在恶性肿瘤进展中发挥重要作用，越来越多的研究尝试将其作为治疗靶点，从而开发出新的靶向药物，为肿瘤的临床治疗提供新的思路。