张春霞 徐贵生 时金艳

结核病作为全球十大死因之一，是重大的公共卫生问题，其中耐多药结核病严重威胁人类健康，成为我国结核病控制的难点和重点问题[1]。世界卫生组织2020年全球结核病报告显示，2019年全球范围内估计有1000万例新发结核病患者，约3.3%(46.5万例)的初治患者和18%的复治患者对利福平耐药，其中耐多药结核病患者约占78%，为36.3万例[2]。耐多药结核病患者治疗时间长达2年，治疗药品由多种二线抗结核药品组成，这些药品对患者的不良反应大，对耐多药结核病患者的治疗成功率仅为54.0%[3-4]。耐多药结核病的诊断对其防治具有重要意义，笔者对耐多药结核病的诊断方法进展进行综述，以期为耐多药结核病的防治提供科学依据。

耐多药结核病的诊断方法

耐多药结核病是指结核病患者感染的结核分枝杆菌经体外药物敏感性试验证实至少同时对异烟肼和利福平耐药[5]。耐多药结核分枝杆菌耐药机制大致可分为3种类型：(1)降低细胞膜的通透性和外排泵机制；(2)产生降解或灭活酶类；(3)改变抗结核药品作用的靶位[6]。目前，耐多药结核病的诊断方法主要包括以下几种。

一、传统培养基培养方法

耐多药结核病的成功诊断和治疗基于药物敏感性试验的结果。药物敏感性试验包括通过培养基培养观察结核分枝杆菌对抗结核药品的敏感性和检测结核分枝杆菌相关耐药基因的分子生物学检测技术[7]。传统表型药物敏感性试验包括绝对浓度法、比例法、抗性比率法；其中最为常用的是比例法；由于实验技术的成熟，绝对浓度法使用也较为广泛，这些方法敏感度高，临床相关性好[8-9]。固体培养基培养的方法包括世界卫生组织推荐使用的以琼脂为基质的MiddleBrook 7H10/7H11等方法。由于结核分枝杆菌培养所需的时间较长，获得药物敏感性试验结果需要2～3个月的时间[10]，液体培养基能够克服其不足，液体培养基的方法即让结核分枝杆菌在液体培养基中生长，培养基中往往添加促生长因子，能够为结核分枝杆菌的生长提供充足营养，液体培养基中还加入能够抑制多种杂菌生长的抗生素。液体培养基主要有手工培养法和自动培养法。手工培养法有MiddleBrook 7H9和Sauton培养基，自动培养法有BACTEC 460、BACTEC MGIT 960、BacT/ALERT3D系统、VersaTrek分枝杆菌液体培养系统，该种类型的培养基能够提高结核分枝杆菌分离阳性率，减少培养所需时间[11]。其中在液体培养基体系中，最常用的培养基是BACTEC MGIT 960，该培养基的原理是通过检测二氧化碳的产生和结核分枝杆菌生长指示管氧气的消耗量来进行耐药性的检测[12]。

二、分子药物敏感性试验技术

分子药物敏感性试验技术的发展克服了传统表型药物敏感性试验所需时间较长的缺点。这些检测技术可以通过扩增核酸来诊断耐多药结核病，通过识别特定基因的碱基突变来检测结核分枝杆菌的耐药性[13]。这些基因型检测比表型药物敏感性试验更快速和准确。分子药物敏感性试验大致可分为：基于探针的检测技术、基于基因测序技术的检测方法和其他分子生物学检测技术。

(一)基于探针的药物敏感性试验检测技术

基于探针的药物敏感性试验检测技术包括线性探针检测(line probe assays)和GeneXpert MTB/RIF。2008年，世界卫生组织批准了使用线性探针技术用于结核病和耐药结核病的诊断[14]。2016年，世界卫生组织推荐在培养阳性或痰涂片阳性标本患者中使用线性探针检测和MTBDRplus技术，用于耐药结核病以及异烟肼、利福平耐药性的检测[15-16]。MTBDRplus技术是一种半自动化的基因型检测方法，包括DNA提取、多重聚合酶链反应(PCR)扩增和反向杂交3个步骤。该方法可以检测利福平rpoB耐药基因及异烟肼katG耐药基因和inhA启动子区域的突变[17]。Siddiqui等[18]的研究显示，MTBDRplus对利福平检测的敏感度为98.8%，对异烟肼检测的敏感度为90.6%。2018年，世界卫生组织推荐将GenoType MTBDRsl用于耐多药结核病的诊断，其可以检测结核分枝杆菌的乙胺丁醇耐药基因embB突变、氟喹诺酮类药品的gyrA和gyrB耐药基因突变和注射类药品(卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素)的rrs耐药基因突变[5,19]。2020年，世界卫生组织建议使用GeneXpert MTB/RIF作为成人和儿童肺部和肺外结核耐药性的初步诊断方法，如对结核性脑膜炎和淋巴结结核的诊断[16]。GeneXpert MTB/RIF是一种基于实时PCR的全自动分子检测方法，用于检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性。该检测方法可在2 h内得到检测结果。Yasemin等[20]的研究显示，GeneXpert MTB/RIF的敏感度和特异度分别为92.4%和97.1%。相较于GeneXpert MTB/RIF，GeneXpert MTB/RIF Ultra对于结核分枝杆菌较少的标本，尤其是涂片阴性、培养阳性的标本(主要来源于并发HIV感染的人群)、儿科标本和肺外结核标本(特别是脑脊液标本)，检测的敏感度增加。Shao等[21]采用GeneXpert MTB/RIF Ultra 对结核性脑膜炎患者的耐药性进行检测，敏感度和特异度分别为93%和100%。但GeneXpert MTB/RIF Ultra诊断的准确性还需要更多的研究加以佐证。

(二)其他分子生物学检测技术

该类检测技术有聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)，大多数情况下细菌的DNA片段中单一的碱基置换就足以引起单链DNA空间构象发生改变。发生的改变能够导致该单链DNA电泳迁移率发生改变。PCR-SSCP的原理正是用电泳的方法将含有突变的DNA片段与正常的DNA片段比较后进行区分。Ali等[22]通过PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐药基因(katG、rpoB)的突变，对了解结核分枝杆菌对异烟肼、利福平的耐药状况具有重要意义。Choi等[23]的研究显示，异烟肼、利福平和环丙沙星的耐药性与katG、rpoB和gyrA基因突变有关，通过PCR-SSCP检测结核分枝杆菌临床分离株的katG、rpoB和gyrA耐药基因，并且分析临床耐药情况，对指导结核病的治疗具有重要意义。PCR-SSCP技术操作简单，检测所需时间较短，对于设备和试剂无特殊要求，无放射性污染，技术条件成熟，检出率相对较高，使用广泛，但也会受到待测DNA片段长度、聚丙烯酰胺的浓度、缓冲液的离子强度及电泳时的温度等因素的影响，限制了该方法的实际应用，并且PCR-SSCP无法给出突变位点的具体位置和突变性质，故只能用于基因突变的筛选[24-25]。

(三)基因测序技术

1.DNA直接测序法：细菌基因组DNA直接测序法利用PCR扩增需要测量的基因序列，将DNA片段直接进行测序，用测得的碱基序列与标准株的同一段DNA片段进行比较，寻找碱基突变的位置和突变类型，目前DNA直接测序法是检测细菌基因突变所使用的标准[26-27]。Cole等[28]于1998年首次对结核分枝杆菌的基因序列进行了全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)，得到了结核分枝杆菌全基因组的碱基组成数量及其所包含的基因数量，并且发现了结核分枝杆菌的遗传物质与其他细菌的区别，发现了可能导致其发生抗原变异的遗传物质机理。Roa等[29]通过对临床与实验室分离的结核分枝杆菌进行WGS，并与H37Rv标准株进行比较，发现了基因中很多与异烟肼、利福平、链霉素等抗结核药品相关的碱基突变。

2.二代基因测序法：二代基因测序法(next generation gene sequencing，NGS)又称高通量测序(high through put sequencing)，是世界卫生组织推荐的用于快速诊断结核病的方法，能够在减少患者耐药治疗延误的基础上诊断耐药结核病。目前的WGS不能完全区分低耐药性和高耐药性的突变，或者与耐药性无关的一些突变[30-31]。由于在临床分离株中进行WGS存在需要做结核分枝杆菌培养以产生足够菌量的缺点，相比之下，靶向NGS可以直接对临床分离株样本进行测序，该方法可快速运用患者痰液标本进行耐多药检测[32-33]。因此，NGS可以为所有临床相关耐药突变提供深入而全面的数据，可替代目前诊断耐多药结核病的表型诊断方法和分子药物敏感性试验诊断方法。

NGS目前有3种类型。分别是Illumina、Roche 454和ABI-SoliD reprint[34-36]。目前已有许多关于使用NGS对结核分枝杆菌药物敏感性试验进行研究的报道。Ko等[37]将NGS应用于结核分枝杆菌耐药基因分析，得到耐药基因碱基突变情况列表，为今后使用NGS进行结核分枝杆菌耐药基因突变位点的研究提供了参考。Coll等[26]通过对中国、巴基斯坦、马拉维等国的792株结核分枝杆菌基因组表型数据进行分析，编制了一个能预测15种抗结核药品耐药性且包括1325个突变的数据库，并对其中包括异烟肼、利福平、链霉素在内的11种抗结核药品的耐药性进行了验证，建立了一种快速在线“TB-Profiler”分析器，能够直接从原始序列报告结核病耐药性和基因突变类型的分布图。NGS由于具有通量大、检测时间短、精确度高、信息量丰富等优点，被临床广泛应用于耐药结核病，特别是耐多药结核病的检测。

总 结

作为全球重大的公共卫生问题，耐多药结核病的防治对于结核病的防治具有重要意义。因此，对于耐多药结核病的检测显得尤为重要。对于结核病患者，如诊断后不进行耐药检测就盲目使用抗结核药品，容易使患者产生耐药和导致治疗失败。分子药物敏感性试验技术应用于耐药结核病的诊断已得到快速发展。NGS用于耐药结核病的诊断时能够直接从临床样本中提取DNA进行检测，可减少指导临床用药时间，并能够对菌株的毒力与进化谱系进行分析，对研究耐多药结核病的致病机制和传播机制具有重要意义，同时使患者能够尽早接受耐药治疗，降低疾病传播的风险，对结核病的防治具有重要意义。