何翼君 张浩然 辛赫男 高磊

作为全球结核病高负担国家之一，我国结核病患者基数庞大，潜伏感染者众多。世界卫生组织最新颁布的《2020年全球结核病报告》显示，2019年中国估算结核病新发患者83.3万例，估算结核病发病率为58/10万[1]。据模型估算，我国约有3.6亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[2]，其中绝大多数的感染者将长期处于潜伏感染状态，约有5%～10%的人可能在一生中发展为活动性肺结核[3]，因此结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者是一个庞大的潜在“患者库”。针对肺结核患者的儿童密切接触者、免疫抑制剂使用者、HIV感染者等高危人群开展MTB感染检测和预防性治疗是结核病防控策略的重要环节，但目前仍缺乏感染检测的金标准。当前，MTB感染的检测方法主要是基于特异性细胞免疫反应的免疫学检测方法，其中结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)应用历史悠久，操作简便，技术成本较低，因此在结核病高负担国家的MTB感染检测和结核病辅助诊断工作中发挥着重要作用。然而，TST结果易受卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)接种、环境非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria，NTM)感染、宿主免疫状态等多种因素的影响。随着γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)和基于其他反应原的皮肤试验等新的技术方法的出现，TST的应用价值受到广泛关注和挑战。笔者系统梳理了TST用于MTB感染检测和结核病辅助诊断的技术特点和应用现状，并提出了进一步优化和规范其应用的建议。

TST的概述

一、TST的技术原理和结果解读

TST是基于Ⅳ型变态反应的一种以结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)为抗原诱发迟发型超敏反应的皮内检测方法。MTB感染者体内可产生具有结核抗原识别能力的致敏T淋巴细胞，当机体中存在的致敏T淋巴细胞再次受到相应的MTB抗原刺激，多种可溶性淋巴因子的释放导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部聚集、浸润，局部出现红肿硬结，通过测量硬结的平均直径作为判断是否感染的标准。Mantoux检测法是至今使用最广泛的皮内注射法。医务人员采用Mantoux技术在受试者左前臂掌侧前1/3中央皮内注射0.1 ml 5个单位(5 IU)PPD，以局部出现7～8 mm大小的圆形橘皮样皮丘为宜，经48～96 h后测量局部硬结平均直径的大小。根据2018年开始实施的新版《WS 288—2017 肺结核诊断》(以下简称《标准》)，硬结平均直径<5 mm或无反应者为阴性；硬结平均直径≥5 mm者为阳性；硬结平均直径5～10 mm 者为一般阳性；硬结平均直径10～15 mm者为中度阳性；硬结平均直径≥15 mm或局部出现双圈、水泡、坏死及淋巴管炎者为强阳性[4]。对于患有急性传染病、对多种药品过敏、无法配合查验皮肤试验结果，以及经临床医生判定不适合进行TST的人员，不推荐行TST。另外，考虑到TST易受多种因素的影响，在进行结果解读时应结合检测对象皮肤反应的硬结平均直径大小、暴露史、基础疾病史、BCG接种史等进行综合判断。

二、TST的研发历史

1890年，德国细菌学家罗伯特·柯赫(Robert·Koch)首次采用旧结核菌素(old tuberculin，OT)对结核病患者开展治疗。OT为MTB在液体培养基中生长和分解的可溶性物质的浓缩液，同时还包括一些与活性无关的多糖及培养基中的各种成分，生产工艺粗糙，成分复杂，易发生非特异性反应。最终，罗伯特·柯赫对患者实施的治疗失败，但为后续PPD的诞生奠定了重要基础[5]。1907年，奥地利儿科医生Von Pirquet发明了结核菌素皮肤刮种法并首次系统地对OT作用后的反应加以解读，结核菌素划伤区域炎性反应与对照区域明显不同且炎性反应区域平均直径≥5 mm则定义为阳性反应，24～48 h后出现阳性反应表明患者曾感染过MTB，阴性反应则排除了活动性肺结核[6-7]。1934年，Florence B.Seibert采用更加可靠标准的操作流程，利用硫酸铵盐析法制备出效价和纯度更高的PPD[8]。1944年，美国将改进后的PPD产品更名为PPD-S。鉴于PPD-S的纯度和效价的提升，1952年世界卫生组织正式将其确定为结核菌素的国际标准[9]。目前，PPD试剂采用两种单位表示，国际单位(international unit，IU)和结核菌素单位(tuberculin unit，TU)。根据生产PPD所用菌株和工艺的不同，国外使用的PPD产品分类主要包括PPD-S、PPD-RT23、PPDIC-65等[10]，我国生产的PPD主要包括TB-PPD和BCG-PPD[11]。

TST的应用

一、MTB感染检测

目前，MTB感染检测尚缺乏金标准，TST和IGRA是世界卫生组织推荐的两种免疫学检测方法。尽管IGRA可实现MTB感染的体外检测，所使用的抗原与BCG菌株及绝大多数NTM的抗原没有交叉，具有良好的特异度，但由于IGRA对检测条件和技术的要求相对更高，需要具备完整的实验设施以及经过专业培训的操作人员及适当的质量控制程序，限制了其在欠发达地区的应用和推广。而TST因操作简便、检测成本较低，在全球范围内尤其是高负担国家的应用更为广泛。

2000年，我国第四次全国结核病流行病学抽样调查首次开展大规模MTB感染率调查，此次调查通过分层整群等比例抽样的方法对全国59个调查点的66 456名调查对象采用TST进行了MTB感染筛查。调查结果显示，TST阳性(TST≥6 mm)人数为29 553人，全人群MTB感染率为44.5%[12]。2013年，笔者团队针对我国不同结核病疫情地区共计2万余名农村常住人口(≥5岁)同时采用TST和IGRA开展了MTB感染的流行病学调查[13]。结果显示，TST阳性率(TST≥10 mm)为28%(不同地区为14%～42%)，其中有卡痕者和无卡痕者的TST阳性率分别为32%和24%(P<0.001)；IGRA阳性率为19%(不同地区为15%～24%)，有无卡痕对IGRA阳性率的影响差异无统计学意义。在调查对象中，TST和IGRA结果的一致性并不理想(Kappa值为0.485)，TST阳性率受BCG接种尤其是加强免疫接种的影响明显。因此，考虑到我国是BCG普遍接种的国家，基于TST的流行病学调查结果可能会过高估计我国MTB感染的负担。

二、结核病的辅助诊断

据估计，我国每年报告的活动性肺结核患者中，菌阴肺结核(临床诊断肺结核)约占全部活动性肺结核患者的40%以上[1]。菌阴肺结核的诊断和疗效评估因缺乏病原学金标准的评价指标，需要参考其他实验室检测结果。因此，MTB感染检测结果在辅助诊断菌阴肺结核方面发挥着重要作用。2018年开始实施的新版《标准》将免疫学检查列为菌阴肺结核的辅助诊断检测方法之一。在结核病细菌学、分子生物学、病理学检查均为阴性的情况下，经鉴别诊断排除其他肺部疾病，胸部影像学检查符合活动性肺结核表现，同时TST检查中度阳性或强阳性、IGRA阳性或结核抗体阳性，可定义为临床诊断肺结核。另外，相较于成人结核病，儿童结核病临床表现具有多样性且缺乏特异性，标本采集困难，病原学诊断技术往往不能满足儿童结核病的诊断需求。在此种情况下，MTB感染检测作为辅助诊断工具发挥了更大优势。2016年发表的一篇Meta分析系统评价了TST和IGRA在免疫功能正常的儿童中辅助诊断活动性肺结核的应用，结果显示在特异度上TST(86.3%)低于IGRA(95.4%～96.8%)，但TST与IGRA敏感度相似(TST为88.2%，IGRA为88.5%～89.6%)，提示TST在辅助诊断儿童肺结核方面仍然具有重要的应用价值[14]。

三、重点人群的感染监测

学校作为人群密集场所，学生群体一直是结核病防控的重点人群。为加强学校结核病防控工作，《学校结核病防控工作规范(2017版)》(以下简称《规范》)[15]和《中国学校结核病防控指南(2020版)》[16]陆续出台。文件关于学校结核病疫情密切接触者的筛查方法中均指出，15岁以下的密切接触者应先进行肺结核症状调查和TST筛查，对具有肺结核可疑症状者或TST强阳性者开展胸部X线摄片检查，以便早期发现感染者和肺结核患者。这一举措的落实对于降低学校结核病传播风险、保护师生健康将发挥重要作用。

另外，研究显示大约5%的新发感染者可能在感染后1～2年内发病。因此，新发感染者也是结核病防控的重点人群[3, 17]。利用TST在密切接触者、医务人员等人群中进行MTB感染的连续监测成为发现新发感染者的重要手段。国内外对连续监测过程中TST结果的转阳有明确的定义：感染阴性时的TST反应<5 mm时，重复检测结果>10 mm定义为转阳；如果感染阴性时的结果为5～9 mm，转阳定义为比之前结果增加10 mm或更高[18-19]。2009—2011年，Adams等[20]对南非地区7家医疗机构的医护人员进行了一项为期2年的前瞻性队列研究，共505名医护人员分别在基线和12个月以后接受TST和IGRA检测，后续随访过程中共13名TST基线阴性参与者转阳(≥10 mm，且相较于基线至少增加10 mm)，根据TST转阳结果估算结核新发感染率为38%(95%CI：22%～56%)，医护人员在1年内受到感染的风险约是以社区人群为基础的对照组的3.5倍。

因此，在学生、非职业暴露的密切接触者、职业暴露的医务人员等重点人群中利用TST连续监测感染状态的变化，可以早期发现新发感染者，界定预防干预的目标人群，这也将成为完善我国“关口前移”防控策略的重要研究方向。

TST结果的影响因素

一、BCG接种及接种策略

BCG是减毒的牛分枝杆菌菌苗，是目前临床上惟一批准使用的结核病疫苗，因其对儿童结核性脑膜炎和粟粒性肺结核表现出良好的保护效果[21]，已被大多数国家和地区尤其是结核病高负担国家列入免疫接种计划。由于BCG和PPD含有很多共同抗原成分，因此TST的特异性容易受到BCG接种的影响。

2006年，一项系统综述报道在婴儿期接种BCG的240 203名研究对象(来自24项研究)中，20 406名(8.5%)研究对象TST≥10 mm归因于BCG的接种；当BCG接种10年后再次进行TST检测时，仅有1%(56/5639)的调查对象TST呈阳性。而在1岁后接种BCG的12 728名研究对象(来自12项研究)中，有5314名(41.8%)TST≥10 mm归因于BCG的接种，BCG接种10年后仍有21.2%(191/898)的调查对象TST呈阳性。研究结果提示，婴儿期接种BCG对TST试验结果影响较小，但婴儿期后再接种BCG会对TST结果产生更持久的影响[22]。

除接种年龄外，BCG接种策略(是否复种)也明显影响TST结果。1997年之前有近20年时间我国免疫规划采取的是BCG加强免疫策略，也就是在初生、7岁和12岁进行3次BCG接种。研究发现，BCG加强免疫较现行的初生儿一次性接种BCG对TST结果的影响更明显[23]。因此，在BCG广泛接种的国家，采用TST进行MTB感染率调查和感染负担评估时，应充分考虑当地BCG接种策略对评估结果的影响。

二、NTM感染

除BCG外，因存在共同抗原，NTM感染也会对TST结果产生影响。2006年国外一项共纳入1 169 105 名调查对象(来自18项研究)的Meta分析提示，不同地区由于NTM感染导致的TST假阳性率为0.1%～2.3%[22]。2016年，一项针对我国大陆地区疑似结核病患者NTM感染率的Meta 分析显示，该人群的NTM感染率约为6.3%，其中我国东南部地区结核病疑似患者NTM感染率最高(约为8.6%)[24]。该研究提示NTM感染在我国普遍流行，目前国内尚未针对NTM感染对TST结果的影响开展系统评估。

三、宿主自身的免疫状态

鉴于TST的检测原理是基于特异性的T淋巴细胞免疫反应。因此，宿主自身的免疫状态会直接影响TST的表现。研究发现TST在免疫缺陷人群中辅助诊断结核病时，其敏感度明显降低。2009—2010年，韩国一项前瞻性研究针对119例免疫缺陷病患者开展TST和IGRA检测，评价两种方法诊断涂阴肺结核的表现，以培养阳性的肺结核患者或病原学阴性但有疑似活动性肺结核影像学表现并完成抗结核治疗的患者作为金标准。研究发现，TST(≥10 mm)的敏感度为41%，IGRA的敏感度为59%～72%[25]。另外，TST在免疫功能正常的儿童(0～18岁)中诊断病原学阳性结核病的敏感度为88%(95%CI：79%～94%)[14]，但在HIV感染者或患有其他免疫缺陷病的儿童中其敏感度仅为54%(95%CI：49%～59%)[26]。

另外，TST在免疫缺陷人群中检测MTB感染时，其敏感度也会受到影响。两项针对免疫缺陷人群MTB感染率调查的系统综述显示，在器官移植候选者和血液透析患者中，TST的敏感度分别仅为46%(95%CI：38%～54%)和31%(95%CI：26%～36%)[27-28]。基于此，2018年开始实施的《标准》[4]在对HIV阳性、接受免疫抑制剂治疗>1个月、与涂片阳性肺结核患者有密切接触的5岁以下儿童等免疫缺陷人群开展TST检测时，以PPD硬结平均直径≥5 mm作为阳性反应，以提高检测结果的敏感度。另外，考虑到检测方法的局限性，2020年世界卫生组织最新发布的《世界卫生组织结核病综合指南：结核病预防性治疗》也不再将MTB感染检测作为在HIV感染者和5岁以下儿童密切接触者人群中开展预防性治疗的先决条件[29]。

四、增强效应

1955年，Magnus和Edwards首次提出TST增强效应的概念[30]，是指在没有新感染的情况下，已经致敏的机体进行第二次TST时反应较第一次增强。对于远期感染者或免疫抑制人群来说，增强效应可以减少假阴性的结果，提高感染检测的敏感度，但是也容易与新发感染导致的转阳结果混淆。考虑到新发感染导致的TST转阳存在3～8周的窗口期，如果在1～3周内出现第二次TST反应增加，并且期间几乎没有MTB暴露的可能性，那么这种情况很可能归因于增强效应而非新发感染[18]。

Salles等[31]为评估肺结核患者的密切接触者中增强效应发生率开展了回顾性队列研究，54%(572/1060)的密切接触者首次TST结果为阴性(TST≤4 mm)，对其中79%(455/572)的TST阴性密切接触者开展第二次TST时，有6%(28/455)出现增强效应(TST≥10 mm，且相较于第一次TST结果至少增加6 mm)，而且出现增强效应的28名密切接触者在随后2年随访过程中均未发生活动性结核病。由于目前没有检测技术可以区分近期感染和远期感染，如何有效区分增强效应和新近感染引起的阳性反应是解读TST连续检测结果时可能面临的重要问题。针对需要借助增强效应获得准确TST结果的人群，可以在第一次TST筛查之后的1～3周内在另一只手臂上再次进行TST检测，并且以第二次TST结果作为判定感染状态的依据用于指导临床决策[18]。

TST在我国的应用及优化

相较于IGRA使用单一截断值作为阳性判断标准，TST根据不同人群特征选择不同的截断值，提高了检测结果的精细化和准确性。《标准》[4]对不同特征人群应用不同截断值作为TST阳性的评价标准：针对HIV阳性、接受免疫抑制剂治疗>1个月、与涂片阳性肺结核患者有密切接触的5岁以下儿童等，硬结平均直径≥5 mm判定为阳性反应；针对于生活居住在BCG接种地区或NTM感染流行地区的人群，硬结平均直径≥10 mm判定为阳性反应；硬结平均直径≥15 mm或局部出现水泡、坏死、淋巴管炎等判定为强阳性反应。2020年，《中国结核病预防控制工作技术规范(2020年版)》[32]再次对TST检测MTB感染的结果判定原则进行了细化：针对无BCG接种史、HIV阳性、接受免疫抑制剂治疗>1个月和与病原学阳性肺结核患者有密切接触的5岁以下儿童等人群，TST硬结平均直径≥5 mm者视为MTB感染；对有BCG接种史且TST硬结平均直径≥10 mm者视为MTB感染。由此可见，TST的应用和结果解读也在逐步适应精准医学的要求，进一步细化和优化TST在我国不同人群的应用值得探讨。

一、优化TST的应用策略

考虑到临床诊断和人群筛查等不同应用场景对产品/技术在特异度和敏感度等方面的表现有不同需求，对TST应用价值的评价也应该考虑其在不同应用场景下的功能定位和目标人群，从而有针对性地提出优化建议，避免一概而论。研究发现，在进行重点人群MTB感染检测的时候相对于单独使用TST来说，TST-IGRA两步法(即首先采用TST进行筛查，对TST阳性的个体再采用IGRA进行确认)可以在有效保证较低检测成本的同时提高检测结果的特异度[33]。目前，多个国家已将TST-IGRA两步法作为MTB感染检测的可选策略纳入国家结核病防控指南[34-36]。使用TST-IGRA两步法可减少TST假阳性结果造成的不必要的后续患者发现成本或预防干预资源投入，是符合成本-效益的MTB感染筛查策略[37-39]。关于TST-IGRA两步法的适用人群，除其他国家建议的人群，如低结核病负担地区的密切接触者[40]、接种BCG的医务人员[41]、启动肿瘤坏死因子抑制剂治疗前的患者[42]等，笔者团队针对其在学生人群MTB感染筛查工作中的应用价值也进行过探讨[33]，发现在我国BCG普遍接种的前提下，在入校新生中采用两步法进行MTB感染的筛查对于准确界定高危人群、实施精准干预具有重要的实践意义，值得进一步探索[43-44]。

另外，基于早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigenic target 6，ESAT-6)和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)皮肤试验的成功开发也为TST应用策略的优化提供了更多可能性[45-46]。在保持复合抗原具有较高检测敏感度的基础上，利用生产用菌株基因改造或生产工艺改进等手段进一步提升PPD的特异性表现也值得探索。

二、细化TST的结果解读规范

TST的应用历史悠久、适用人群庞大，在进一步规范操作标准的基础上加强实施性研究，科学评价TST在不同人群的应用表现并在此基础上细化结果解读规范将具有重要意义。新版《标准》结合不同人群的生物学特征，细化TST截断值的选择，使得TST的解读更具科学性，有效控制了既往BCG接种、NTM感染、宿主免疫状态等影响因素对TST结果的干扰。不过，针对不同特征的目标人群对检测结果准确性的不同需求，还需进一步探索TST应用和结果解读的精细化和标准化，这也是“精准干预”工作的重要需求。其中，利用《定点医疗机构医院信息系统》《结核病信息管理系统》和《基本公共卫生服务管理信息系统》，能够更加系统地收集和分析TST在不同人群的应用信息，将为上述研究提供重要的数据资源[47]。

综上所述，TST在我国的现代结核病防控工作中仍然具有其自身独特的应用优势和市场价值。在系统分析的基础上，进一步优化和规范其在不同目标人群中的应用及结果解读对于发挥其技术优势，更好地服务结核病防控工作具有重要的实践意义。