张小龙，沈佳晨，聂 贞，王美红，蒋 玥，卜仕金*

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

随着养猪业规模化和集约化的迅速发展，猪球虫病的危害也日益凸显，给养殖户造成巨大经济损失。目前药物治疗仍然是防治猪球虫病的主要手段。帕托珠利(ponazuril)又名妥曲珠利砜，是妥曲珠利的主要活性代谢产物，其口服糊剂(商品名Marquis®)已批准用于治疗马原生动物性脑脊髓炎(EPM)，已有研究显示帕托珠利对畜禽球虫病可能也有良好的防治效果[1-2]。与妥曲珠利相比，帕托珠利易于通过血脑屏障[3]。目前帕托珠利在山羊[4]、美洲驼[5]、牛[6]和马[3]等实验动物体内的药物动力学研究报道较多，但在猪及其他食品动物的药物动力学研究国内报道甚少。前期临床有效性试验结果表明，湖北龙翔药业科技股份有限公司研制了5%帕托珠利混悬液，按15～20 mg/kg bw单剂量，置于3～5日龄仔猪舌根处，可有效防治人工感染的仔猪球虫病。本试验对5%帕托珠利混悬液在猪体内的药动学特征及口服生物利用度进行了研究，以期为帕托珠利混悬液的临床合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 帕托珠利标准品：含量99.6%，批号180502 WS；帕托珠利混悬口服液：含量5%，规格100 mL，生产批号为20180501；帕托珠利注射液：含量6%，规格100 mL，生产批号为19092301，仅用于本试验开展生物利用度研究；生产商均为湖北龙翔药业科技股份有限公司。甲醇、乙腈为色谱级，购自美国TEDIA公司；乙酸，色谱纯，购自德国CNW公司；乙酸乙酯，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与耗材 高效液相色谱仪(配备紫外检测器)Agilent 1260，安捷伦公司；电子分析天平(感量0.0001 g)，德国赛多丽丝天平公司；超声仪，KS-250D，宁波科生仪器厂；超纯水仪，UPH-11-20T，成都超纯科技有限公司；氮吹仪，N-EVAP-12，Organomation Associates 公司；台式高速冷冻离心机，Centrifuge 5810R，Eppendorf公司；微型涡旋混合仪，WH-1，上海沪西分析仪器有限公司。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，安捷伦公司；离心管，2 mL、5 mL，美国 Axygen 公司；微量移液器，10 μL、200 μL、1000 μL，Eppendorf公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 流动相 将乙腈与0.2%乙酸水溶液按53∶47(V/V)比例混匀，经0.45 μm有机滤膜过滤后，超声脱气40 min即可，现配现用。

1.3.2 帕托珠利标准液和工作液 帕托珠利标准储备液：准确称取约10.0 mg帕托珠利标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，与-20 ℃冰箱中保存。帕托珠利工作液：准确吸取适量帕托珠利标准储备液，用流动相稀释制备浓度为1、5、10、20、50、100 μg/mL的标准工作液，现配现用。

1.3.3 帕托珠利空白血浆添加样品 准确吸取180 μL空白猪血浆，加入20 μL帕托珠利工作液，涡旋混匀0.5 min，即可制得帕托珠利空白血浆添加样品。

1.4 试验动物 20头40日龄的健康杜梅二元杂交黑猪(公母各半)，购自江苏盐城市大丰区中北畜牧场，平均体重约11.73±1.83 kg。试验前经一周的适应期后从中选择8头临床健康的母猪和8头临床健康的公猪用于实验。试验前采用耳标标记，母猪编号为1～8号，公猪编号为9～16号。试验前1 d检查确认处于良好的健康状态。试验期间常规饲养，自由饮水和进食，饲料均为不添加任何药物的全价饲料。

1.5 方法

1.5.1 试验设计与给药方案 采用平行试验设计。16头健康杜梅二元杂交仔猪随机分为两组，每组8头，公母各半。所有动物给药前禁食12 h，给药后2 h恢复正常饮食。口服给药组，置舌根部给药，单剂量15 mg/kg bw；静脉给药组，经耳缘静脉给药，单剂量6 mg/kg bw。具体分组与给药方案见表1。

表1 试验分组与给药方案Tab 1 The experiment design and the dosage regimen

1.5.2 血样采集与保存 猪采用仰卧保定后经前腔静脉采血。所有动物给药前均采集一次空白血，记为0 min。口服给药组，分别在给药后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、21 d、26 d、31 d进行采血；静脉给药组，分别在给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、21 d、26 d、31 d进行采血。每次采血量为3 mL，采用肝素抗凝。全血经5000 r/min离心10 min后吸取上层血浆与2 mL离心管中，-20 ℃冷冻保存。以给药时刻记为0时刻，采血点均以0时刻为基准，前4 h内采血点理论偏差应在±2 min 以内，4 h后采血点理论偏差应在±5 min以内。

1.5.3 血浆中帕托珠利含量的测定 猪血浆中帕托珠利含量的测定采用经验证的HPLC法测定。准确吸取猪血浆样品200 μL于2 mL离心管中，加入乙酸乙酯1 mL涡旋振荡3 min，12000 r/min离心10 min，将上清液移至5 mL离心管中，下层残渣用乙酸乙酯0.5 mL重复提取一次，合并上清液。上清液经氮吹仪或离心浓缩仪(40 ℃)吹干，流动相复溶，涡旋振荡3 min，12000 r/min离心10 min，取上清经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC分析。

色谱条件：色谱柱 安捷伦 ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈与0.2%乙酸水(53∶47，V/V);流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL;紫外检测波长：250 nm。

将猪血浆样品按上述的血浆预处理方法处理后，再按上述的色谱条件进行分析，测出待测物的峰面积，以外标法定量，代入当日随行的标准曲线，计算出猪血浆中帕托珠利的含量。

同一头猪的血浆样品在同一分析批内完成，每个分析批的质控样品数为样品总数的5%，不少于3个质控样品(0.2、5、7.5 μg/mL 3个添加浓度水平)，质控样品的偏差应小于15%。

1.5.4 数据分析 将实测后的各动物血药浓度-时间数据按对应的格式整理后，采用Winnonlin5.2软件计算药动学参数，得出每个动物单独的以及每组动物平均的药动学参数并进行数据的分析比较。采用Graphad prism8.0绘制帕托珠利在猪血浆中的药时曲线。绝对生物利用度的计算公式如下：

式中：F为生物利用度；AUCpo为口服药时曲线下面积；AUCiv为静注药时曲线下面积；Div为静注给药剂量；Dpo为口服给药剂量。

2 结果与分析

2.1 猪血浆中帕托珠利含量测定的HPLC方法学验证 空白血浆、帕托珠利标准品、空白血浆添加帕托珠利标准品HPLC色谱图见图1，在本课题组已建立的HPLC检测条件下,血浆样品中帕托珠利的出峰时间约8.9 min，峰形良好，主峰与杂质峰完全分离。在0.10～10.00 μg/mL范围内线性关系良好(R2≥0.999)。方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.04 μg/mL和0.1 μg/mL，回收率均大于90%，批内和批间的精密度RSD分别小于5%和9%。

A：空白血浆; B: 0.1 μg/mL帕托珠利标准品; C:空白血浆添加帕托珠利标准品A：Blank plasma; B: Ponazuril standard at 0.1 μg/mL; C: Spiked plasma sample at the level of 0.1 μg/mL图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 给药后猪血浆中帕托珠利色谱图 给药后猪血浆中帕托珠利的实测色谱图见图2。

D: 5号猪口服给药4 d后; E: 14号猪静注给药5 min后D: 4 days in pig No 5 after oral administration; E: 5 minutes in pig No 14 after intravenous injection图2 给药后帕托珠利色谱图Fig 2 Chromatogram of ponazuril after administration

2.3 血药浓度与药动学参数 猪按6 mg/kg bw单剂量静注帕托珠利注射液后，猪血浆中帕托珠利的平均药时曲线见图3，药动学参数见表2。由表可知，静注给药后帕托珠利在仔猪体内的主要药动学参数如下：平均消除半衰期(T1/2β)为136.98 h，平均滞留时间(MRT)为165.92 h，平均药时曲线下面积(AUC0-t)为1570.97 h·μg/mL，平均表观分布容积(Vz)为695.59 mL/kg，平均血浆清除率(CL)为3.77 mL/(h·kg)。

猪按15 mg/kg bw单剂量口服帕托珠利混悬液后，猪血浆中帕托珠利的平均药时曲线见图3，药动学参数见表2。由表可知，单剂量口服帕托珠利混悬液后帕托珠利在仔猪体内主要药动学参数如下：平均T1/2β为134.05 h，平均Tmax为42.00 h，平均Cmax为14.03 μg/mL，平均MRT为173.19 h，平均AUC0-t为2831.00 h·μg/mL，帕托珠利混悬液口服给药绝对生物利用度为72.08%。

图3 猪单剂量静注和单剂量口服后血浆中帕托珠利的平均药时曲线Fig 3 The plasma concentration-time curve of ponazuril after intravenous injection and oral administration

表2 单剂量静注帕托珠利注射液和口服帕托珠利混悬液后的药动学参数Tab 2 The pharmacokinetics parameters of ponazuril in plasma of piglet after intravenous injection and oral

3 讨论与结论

3.1 帕托珠利血药浓度测定方法 据报道，目前帕托珠利血药浓度测定法主要有高效液相色谱法(HPLC)[7]、高效液相色谱-质谱法(LC-MS)[8-9]等。本试验参考相关文献资料建立了HPLC外标法测定猪血浆中帕托珠利含量的测定方法。血浆中帕托珠利采用乙酸乙酯萃取药物，置于40 ℃离心浓缩仪吹干，缩短了样品处理时间，不仅操作方便，而且回收率高且杂质峰少。以乙腈-0.2%乙酸水为流动相，待测物帕托珠利出峰时间稳定，峰形尖锐，与血浆中其余杂质完全分离。在上述血浆样品处理方法和色谱检测条件下，血浆中帕托珠利的回收率在90%以上，批内和批间变异系数均小于9%，能满足色谱法测定猪血浆中帕托珠利的相关要求，表明本试验建立的血药浓度检测方法可用于帕托珠利混悬液在猪体内的药物动力学研究。

3.2 猪单剂量静注帕托珠利注射剂后的药动学特征 猪单剂量静注(6 mg/kg bw)帕托珠利注射液后，帕托珠利的平均T1/2β为136.98 h，平均MRT为165.92 h，平均CL为3.77 mL/(h·kg)，表明帕托珠利在猪体内消除速度缓慢。帕托珠利消除半衰期较长在鸡上也有报道[10]，通过单剂量5 mg/kg bw给药，结果显示帕托珠利在鸡体内的消除半衰期为50.32 h，平均滞留时间为72.63 h，体清除率为0.13 mL/h，这可能与均三嗪这类药物的化学性质有关。帕托珠利平均Vz为695.59 mL/kg，表明帕托珠利在猪体内分布较窄，这可能与进入猪体内后可能主要分布在血浆中有关[11]。Dirikolu L等[3]研究表明，给马静注帕托珠利(1 mg/kg bw)后，平均T1/2β为128.99 h，Vz为313.4 mL/kg，这表明在马体内消除同样缓慢，且分布较差，在体内能保持较长时间。Wesolowski CA等[12]研究表明，通过静注途径给药之后，药物在体内会存在血管阶段和稀释阶段。在血管阶段药物以较短的时间进入血浆中，而在稀释阶段，药物会以较长的时间进入到其他组织中去。

3.3 猪单剂量口服帕托珠利混悬液后的药动学特征 猪单剂量口服(15 mg/kg bw)帕托珠利混悬液后，帕托珠利的平均T1/2β为134.05 h，与静注组给药的半衰期(136.98 h)相近，与Zou M等[13]研究的猪单剂量(5 mg/kg bw)口服帕托珠利的T1/2β135.28 h基本一致，表明帕托珠利在猪体内消除缓慢，且远比其前体药物妥曲珠利在猪体内消除慢[14]。这或许与帕托珠利更慢的组织清除率有关[7]。单剂量口服帕托珠利溶液在不同动物体内的消除半衰期也不同，如山羊[4](10 mg/kg bw)为129.00 h，美洲驼[5](20 mg/kg bw)为84.00 h、马[3](2.2 mg/kg bw)为81.24 h、牛[6](5 mg/kg bw)为58.00 h。尽管帕托珠利消除存在一定的种属差异性，但均显示其进入动物体内后消除缓慢。猪口服帕托珠利后的平均Tmax为42.00 h，平均Cmax为14.03 μg/mL，这表明猪口服帕托珠利混悬液吸收缓慢，达峰时间较长，提示帕托珠利在体内可能存在肝肠循环现象。帕托珠利混悬液单剂量口服后平均AUC0-t为2831.00 h·μg/mL，绝对生物利用度F为72.08%，表明帕托珠利混悬液口服给药吸收程度良好。另据Dirikolu L等[3]研究表明，不同溶剂对帕托珠利的生物利用度影响很大，加入DMSO后在马体内的绝对生物利用度可达71%，是用水灌服的3倍。生物利用度研究结果表明，仔猪口服帕托珠利混悬液后能维持较久的血药浓度，这对临床预防哺乳期仔猪的球虫病或许有益。

在前期临床有效性试验确定推荐剂量的基础上，首次评价了帕托珠利混悬液在靶动物体内的药物代谢动力学特征，为其临床中新兽药注册、研发和安全性评价以及临床合理应用提供了依据。湖北龙翔药业科技股份有限公司研制的2.5%帕托珠利混悬液单剂量置舌根部给药后，帕托珠利在猪体内具有分布较差、消除缓慢、达峰时间较长但吸收良好的药动学特征，按临床推荐剂量15～20 mg/kg bw，可用于临床上预防仔猪球虫病的暴发。