刘胜利，刘示杰，刘文龙，马传兴，王克芬，陆利霞

(1.山东隆科特酶制剂有限公司，山东 临沂 276400；2.青岛科技大学 高分子科学与工程学院，山东 青岛 266042；3.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

磷(phosphorus)是动物体内除钙以外含量最丰富的矿物质元素，具有重要的代谢功能[1]和生理功能[2]，在形成和维持骨骼组织、维持渗透压和酸碱平衡[3]、能量利用和转移、蛋白合成、生长和细胞膜平衡[4]及细胞分化等机体活动中起着重要作用，是动物体必需的矿物元素。植物性饲料是猪鸡日粮配制过程中的重要组成部分，植物性饲料中，磷主要以植酸磷的形式存在，谷类籽实原料中的植酸磷含量约占总磷(TP)的 59%～79%，小麦麸中约占 74%，而细米糠可高达93%，油渣饼类为58%～70%[5]。植酸磷只有被植酸酶水解后才能被家禽所利用，因家禽消化道中的植酸酶活性很低，植酸磷基本上不能被利用或者其利用率极低，最终未被消化利用的植酸磷随粪便排出而导致环境污染[6]。饲料中添加植酸酶，可以使饲料原料中的磷获得更深层的应用，进一步促进生产性能，改善饲料营养物质的吸收利用率，从而缓解猪鸡排泄物污染环境的压力。

植酸酶可以降解植酸磷，释放出供动物吸收的磷[7]，还可释放出其他对动物有益的营养物质，使其抗营养作用消除，是现代饲料和养殖业不可缺少的一种安全、无污染的绿色饲料添加剂。植酸酶是一种胞外酶，本质是一种蛋白质，广义上是指与植酸分解相关的一些酶类[8]，植酸酶包括植物源植酸酶、肠黏膜植酸酶、大肠微生物群植酸酶和外源微生物植酸酶[9]。植酸酶可以改善肉鸡对植物性饲粮中植酸磷的利用率[10]。影响植酸酶应用效果的因素有很多，包括植酸酶添加量[11]、磷水平[12]、植酸酶剂型[13]、饲料钙水平[11]、钙磷比[14]和其他因素(动物种类、性别及年龄等)[15-16]。因此，在使用的过程中还要综合全面考虑这些因素。另外植酸酶也可以改善其他营养成分的利用率，如机体的能量代谢[17]、氨基酸[18]、微量元素[19]等。

现代饲料企业的加工工艺对植酸酶的耐温性能要求较高[20]，饲料企业制粒阶段的温度通常在85 ℃左右；不同动物体内内源酶及内环境(包括酸度)对植酸酶的酶活的影响也很显著。邱梅平等[21]研究发现，添加植酸酶使内源酶胰蛋白酶酶活提高了38.88%，淀粉酶的酶活提高了1.25%～18.81%，二糖酶酶活提高了0.37%～13.22%。反过来，内源酶及消化液对植酸酶酶活的影响鲜见报道。陈涛等[22]在体外评估植酸酶的耐酸稳定性时发现，在低于pH 4.0酸性环境中，植酸酶的酶活损失最少的为最佳产品。苗华彪等[23]发现，在猪肠液中4种木聚糖酶耐受4 h后，剩余酶活分别为48%、60%、55%和54%；4种甘露聚糖酶耐受4 h后，剩余酶活分别为48%、65%、58%和11%。梁作理等[24]研究发现，从耐酸性看市场销售的11种植酸酶的酶活稳定性，pH自4.0降至2.5，10号样品酶活自93.15%降至57.12%为最好，11号样品酶活自75.58%降至49.20%为次之，其他样品均很差。为了让畜禽能高效利用饲料中植酸磷，需要选择稳定性好的植酸酶产品，以提高饲养效果。现在市场上植酸酶种类多，对不同饲料原料中植酸磷酶解效率不同，对加工工艺的耐温性能也千差万别，所以建立评估方法进行科学评估显得很迫切。本研究旨在通过建立实验室评估耐热植酸酶的方法，对耐热植酸酶质量进行科学评估，为饲料企业和养殖企业筛选使用耐热植酸酶提供指导和方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料

10 000 U/g耐热植酸酶L1和L2由山东隆科特酶制剂有限公司提供，其他10 000 U/g耐热植酸酶样品A、B、C、D、E，市场采购。底物：含质量分数43%粗蛋白质豆粕，临沂邦基三维油脂有限公司。胃蛋白酶、淀粉酶，Sigma公司；胰蛋白酶、糜蛋白酶，Amresco公司。其他试剂除特殊说明外，均为市售分析纯；水均为符合规定的二级水。清洗试验用器皿不用含磷清洗剂。

1.2 主要仪器设备

SDS-Ⅲ型单胃动物仿生消化系统，湖南中本智能科技发展有限公司；6400型氧弹量热仪，美国Parr公司。

1.3 实验方法

仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、胃缓冲液和小肠缓冲液的配制及仪器运行参数等试验操作参照文献[25]。仿生消化采用鸡模拟消化设置参数；每种样品处理设5个重复，每个重复使用1根消化器。

1.3.1 体外仿生消化对消化液中耐热植酸酶的酶活留存率影响

1)模拟胃消化液配制。用36.5%浓盐酸调节至pH 2.0并定容至500 mL，取250 mL将胃蛋白酶387.5 kU溶解其中，得模拟胃消化液。

2)待测酶液配制。称取酶制剂样品并溶解于pH 2.0 盐酸液，作为待测对照酶液；另用模拟胃消化液溶解各酶制剂样品，作为待测试验酶液。

3)胃缓冲液配制(2 000 mL)。称取NaCl 2.17 g，KCl 1.57 g，溶解于pH 2.0 的盐酸溶液中并定容至2 000 mL。

4)模拟小肠液的配制(22 mL)。将胰蛋白酶(Amresco 0785)11.926 kU、糜蛋白酶(Amresco 0164)2.737 kU、淀粉酶(Sigma A3306)97.153 kU溶解定容至22 mL。

5)小肠前段缓冲液的配制(2 000 mL)。称取无水Na2HPO49.35 g，无水NaH2PO440.99 g，NaCl 11.13 g，KCl 3.09 g，青霉素160万U。溶解后调节pH至6.50，并定容至2 000 mL。

6)小肠后段缓冲液的配制(2 000 mL)。称取无水Na2HPO448.77 g，无水NaH2PO46.77 g，NaCl 10.03 g，KCl 2.79 g，青霉素160万U。溶解后调节pH至6.50，并定容至2 000 mL。

7)模拟胃消化过程。透析袋中加入20 mL模拟胃液。将模拟消化器置于仿生消化系统中，接好管路。对照组和试验组各5根消化器，每组5根模拟消化器间串联连接。参数为温度41 ℃，胃缓冲液流速120 mL/min，消化4 h，去离子水1 500 mL/次清洗，每次清洗40 min，共清洗3次。

8)模拟小肠液消化过程。模拟胃消化后，将2 mL模拟小肠液移入单胃动物仿生消化系统试验组储备室中，对照组储备室中移入2 mL去离子水。参数为温度41 ℃，小肠缓冲液流速120 mL/min，小肠前段消化时间为7.5 h，后段消化时间为7.5 h，去离子水1 500 mL/次清洗，每次清洗40 min，共清洗6次。消化结束后，试验组和对照组的每根消化器各取 1 mL酶液进行酶活测定，计算消化液中酶活留存率，见式(1)。

(1)

1.3.2 体外仿生消化评估耐热植酸酶对植酸磷的酶解率

用沉淀消解法[26]测定43%豆粕中的植酸磷含量，以不同浓度的耐热植酸酶(0.5、1、2、4和8 U/g)采用体外仿生消化[25]酶解43%豆粕中植酸磷(参见1.3.1节)，沉淀消解法测定剩余残渣中植酸磷含量，差量法计算酶解豆粕释放磷的量，见式(2)。每个浓度设5个重复。

酶解豆粕释放磷的量=起始豆粕植酸磷值-豆粕残渣植酸磷值

(2)

1.3.3 水浴法模拟高温制粒对耐热植酸酶酶活的影响

以水浴法模拟饲料的85 ℃高温制粒过程，评估对耐热植酸酶酶活的影响。用pH 5.5缓冲溶液稀释耐热植酸酶的酶活至100 U/mL，在不同温度(85 ℃、90 ℃)水浴中保温3 min后，取出冷却至室温，按照国标GB/T 18634—2009测定酶活，具体计算见式(3)。

存留植酸酶酶活=耐热植酸酶添加量×消化液中酶活留存率

(3)

1.3.4 仿生消化条件下耐热植酸酶L1对豆粕酶解的影响

饲料试样的采集按照GB/T 14699.1—2005进行。将样品粉碎至250 μm，称取1.000 0 g试样于模拟消化器中，同步测定试样干物质含量，运行模拟消化过程[25]，耐热植酸酶添加浓度参照1.3.2节，根据式(3)和表1中耐热植酸酶消化液中留存率，计算存留酶活，并做消化液中存留酶活释放磷的回归分析；通过偏导数法计算出耐热植酸酶存留酶活最佳添加量和释放磷最大值，得出单位耐热植酸酶释放磷量、耐热植酸酶L1的酶活最佳添加量和干物质消化率提高值及酶水解物能值提高值。具体计算见式(4)～(9)。

(4)

式中：DMD为豆粕体外干物质消化率，%；M1为上样豆粕干物质质量，g；M2为未消化残渣干物质质量，g。

(5)

式中：EHGE为豆粕体外酶水解物能值，MJ/kg；GE1为上样豆粕总能，J；GE2为未消化残渣总能，J。

豆粕干物质消化率提高值=试验组豆粕干物质消化率-对照组豆粕干物质消化率

(6)

A=EHGE′-EHGE0

(7)

式中：A为豆粕酶水解物能值提高值，MJ/kg；EHGE′为试验组豆粕酶水解物能值，MJ/kg；EHGE0为对照组豆粕酶水解物能值，MJ/kg。

(8)

式中:PAP为单位耐热酶释放磷量，g/t；Pmax为释放磷最大值，g/t；Mopt为存留酶活最佳添加量，U/g；Ewater为90 ℃水浴3 min植酸酶存留率，%；Edigest为消化液中酶活存留率，%。

(9)

式中，M为最佳酶活添加量，U/g。

1.4 数据处理

用EXCEL对数据进行初步整理，用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，各指标用One-way ANOVA进行显著性分析，用LSD法进行多重比较，结果用平均数±标准误差(Mean±SE)表示，当P<0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 模拟胃肠消化液对耐热植酸酶留存率的影响

梁作理等[24]以不同pH处理11种植酸酶对其酶活的影响，以pH 5.5为标准对照组，结果发现当pH降至3.0和2.5时，10号和11号样相对酶活均最高，分别超过70%和50%，其他样相对酶活均低于50%。本研究中，耐热植酸酶模拟胃肠消化液中酶活留存率如表1所示。由表1可知：在试验条件下模拟胃肠消化液对耐热植酸酶酶活留存率的影响显著，酶活留存率最高的是样品A(73.08%)；样品L2酶活留存率71.64%，属次之；其他样品均较差，差异显著(P<0.05)，酶活留存率最低的为样品L1(51.06%)；在模拟胃肠消化液中按照酶活留存率由高到低的排序是A、L2、C、D、E、B、L1，与梁作理等[24]研究的结果一致。

表1耐热植酸酶模拟胃肠消化液中酶活留存率(n=5)

Table 1 Retention rate of enzyme activity in the simulated gastric digestive juice by different thermostable phytase(n=5)

样品样品比酶活/(U·g-1)消化液存留比酶活/(U·g-1)酶活留存率/%L111 578.95 912.2±93.32f51.06fL211 236.28 049.6±131.77d71.64bA15 281.311 167.6±431.05a73.08aB16 367.59 026.7±85.26b55.15eC13 466.09 050.5±96.66b67.21cD12 126.27 611.6±136.03e62.77dE14 538.08 733.0±190.15c60.07d

2.2 体外消化法评估耐热植酸酶对植酸磷的酶解影响

参照文献[26-27]的相关方法，添加有耐热植酸酶的豆粕，在体外仿生消化结束前后测出植酸磷含量，以差量法计算植酸酶酶解植酸磷的磷释放量，结果如表2所示。

表2 豆粕中添加不同耐热植酸酶体外仿生法测定磷释放量(n=5)Table 2 Phosphorus release amount of adding different thermostable phytase to soybean meal by Bionics method in vitro(n=5)

由表2可知：在含有43%蛋白质豆粕中添加植酸酶0.5 U/g时，磷释放量最高的是样品D和E，分别为935.2和970.3 g/t，样品A的最低(564.6 g/t)，样品间磷释放量差异显著(P<0.05)；在含有43%蛋白质豆粕中添加植酸酶1.0 U/g时，样品A的磷释放量最高(1 180.1 g/t)，样品C的磷释放量最低(707 g/t)，样品间磷释放量差异显著(P<0.05)；在含有43%蛋白质豆粕中的添加植酸酶2.0 U/g时，样品A和B的磷释放量最高，分别为2 013.5 g/t和2 079.4 g/t，样品B的磷释放量最低(1 300.8 g/t)，样品间磷释放量差异显著(P<0.05)；在含有43%蛋白质豆粕中添加植酸酶4.0 U/g时，样品A的磷释放量最高(4 122.2 g/t)，样品C和D的释放量最低，分别为2 136.6 g/t和2 136.1 g/t，样品间磷释放量差异显著(P<0.05)；在含有43%蛋白质豆粕中添加植酸酶8.0 U/g时，样品A的磷释放量最高(4 142.8 g/t)，样品L2、A、B的释放量最低，分别为2 339.3 g/t、2 412 g/t、2 335 g/t，样品间磷释放量差异显著(P<0.05)。由此可见，随耐热植酸酶在豆粕中的添加量逐渐升高时，磷释放量也逐渐升高，这和Dersjant-Li等[28]的研究结果一致。

2.3 仿生消化条件下耐热植酸酶酶解豆粕释放磷的分析

据1.3.2节耐热植酸酶的添加梯度和表1中耐热植酸酶消化液中留存率，对消化液中存留酶活释放磷作回归分析，求出回归方程，并通过偏导数法计算出耐热植酸酶存留酶活最佳添加量和释放磷最大值，结果如表3和表4所示。

表4 不同耐热植酸酶释放磷Table 4 Release phosphorus of different thermostable phytase

由表3可知，耐热植酸酶样品L1释放磷的最大值为4 497.8 g/t，存留酶活最佳添加量为3.239 U/g；样品B释放磷最低为2 329.8 g/t，存留酶活最佳添加量为3.990 U/g。

表3 消化液中存留酶活和释放磷回归分析表Table 3 Regression analysis of phosphorus release amount and retention enzyme activity in digestive juice

由表4可知，单位酶活释放磷值最高的植酸酶样品是L1，为465.51 g/t，单位酶活释放磷最低的植酸酶样品是E，为29.56 g/t，按照单位酶活释放磷由高到低的排序是L1、L2、A、B、C、D、E。

2.4 水浴法模拟高温85 ℃制粒过程对耐热植酸酶酶活的影响

水浴法模拟饲料生产的高温制粒过程对酶活的影响，参照赵春等[20]研究结果及依据调查，饲料企业通常以85 ℃调制制粒。本试验设计以实际制粒温度为85 ℃调制制粒，以88%干物质为基础，比较各植酸酶样品的耐温制粒后的酶活留存率，结果见表5。由表5可知：水浴法3 min 85 ℃的酶活留存率最高的是样品L2(99.5%)，酶活留存率最低的是样品E(7.78%)，差异显著(P<0.05)；同时与各样品生产实际的85 ℃调制制粒的酶活留存率相比，差异显著(P<0.05)；各耐热植酸酶样品水浴法3 min 90 ℃的酶活留存率和实际85 ℃调制制粒的酶活留存率接近，差异不显著(P>0.05)；实际生产85 ℃调制制粒的酶活留存率最高的是样品L2(69.82%)，最低的是样品E(6.99%)。按照实际生产85 ℃调制制粒酶活留存率由高到低的排序是L2、A、L1、B、C、D、E，与水浴法3 min 90 ℃的酶活留存率排序一致，说明在实验室水浴法3 min 90 ℃更适于评估实际生产中的植酸酶酶活。

表5 实际制粒和水浴法模拟制粒对耐热植酸酶酶活的影响(n=5)Table 5 Effects of granulation on different thermostable phytase activity by actual granulation and water bath method(n=5)

2.5 仿生消化条件下L1耐热植酸酶酶解豆粕的效果分析

仿生消化条件下L1耐热植酸酶酶解豆粕的效果见表6。

表6 耐热植酸酶L1酶解豆粕效果(n=5)Table 6 Effects of thermostable phytase L1 on soybean meal(n=5)

由表6可知，在43%豆粕中，随着植酸酶添加量的增加，植酸酶酶解植酸磷释放磷的量逐步提高，用EXCEL求出回归方程，并通过偏导数法计算出耐热植酸酶最佳添加量，结果表明存留酶活最佳添加量为3.239 U/g。建立释放磷(y)和存留酶活添加量(x)之间的二次回归方程：y=-438.64x2+2 841.9x-105.27(R2=0.987 8)，得到最佳酶活添加量为9.663 U/g。随着植酸酶的添加量增加，豆粕中的干物质消化率逐步提高，当耐热植酸酶在豆粕中存留酶活最佳添加量为1.651 U/g时，干物质消化率提高为0.238 1%，此时提升幅度达到最大，得出最佳酶活添加量为4.926 U/g。建立干物质消化率提高值(y)和存留酶活添加量(x)之间的二次回归方程：y=-0.073x2+0.241 1x+0.039(R2=0.965 0)。随着植酸酶的添加水平增加，豆粕中的酶水解物能值逐步提高，存留酶活添加量最佳为1.850 U/g时，酶水解物能值提高值最大为(0.093 4 MJ/kg)，得出本试验条件下最佳酶活添加量为5.518 U/g。建立酶水解物能值提高值(y)和存留酶活添加量(x)之间的二次回归方程：y=-0.023 3x2+0.086 2x+0.013 7(R2=0.932 3)。这与Wealleans等[29]和Moss等[30]研究的结果有一致性。

3 讨论

3.1 基于饲料实际调制制粒条件下的水浴法对耐热植酸酶有效性的评估

饲料加工过程对植酸酶产生的失活作用是限制植酸酶进一步推广应用的关键因素。目前，市场上已有多种耐热植酸酶产品推出，但产品对饲料制粒过程的耐受性能仍然是最受关注的焦点。因此，如何对不同的耐热植酸酶产品进行耐热性能的评价具有重要的现实意义，比较常见的评价植酸酶耐热性能的方法有水浴法[31]、干热法[32]、湿热法[32]和调制制粒评估[20]。无论水浴法、干热法还是湿热法来评估耐热植酸酶的热稳定性都只能作为参考，植酸酶能否耐受制粒的条件、制粒后酶活留存率能达到多少，最具有说服力的就是实际调制制粒后检测得到湿热挤压条件变化后的酶活数据。水浴法是通过高温处理液体酶制剂，评估酶蛋白本身的耐热性能，不适合于评估包被型植酸酶的耐热性，因为热处理时酶液浓度对酶活留存率也有影响。通过大量研究和数据分析，本研究进行了水浴法(3 min 85 ℃和3 min 90 ℃)、85 ℃实际调制制粒对耐热植酸酶酶活留存率的比较分析，建立了基于85 ℃实际调制制粒的水浴法(3 min 90 ℃)来评估耐热植酸酶的有效性，结果表明，水浴法是一种简单快速并易于重现的方法，水浴法3 min 90 ℃更接近85 ℃调制制粒酶活损失情况，该评价方法与马俊孝等[33]报道的不一致，与王海燕等[31]报道的一致。以饲料企业实际调制和制粒后酶活留存率为指标来评估植酸酶耐热性，由于不同厂家设备比如环模孔径、饲料配方类型及配比、饲料制粒过程中的调制温度、调制时间、蒸汽压力等参数有较大的差异，因此需要对水浴法评估的时间和温度及酶液浓度等做出适当调整，使该评估方法更接近于特定饲料厂生产的实际。本研究提供一种调制制粒评估方法和水浴评估方法相结合的评估方法，以实际调制制粒评估的数据为基础，具有可靠性和可行性，与水浴法结合后易于在实验室中进行和重演，适用性好。

3.2 耐热植酸酶有效性的传统体外法评价和体外仿生评价的比较

饲用酶制剂的有效性实验室评价已经成为饲料企业和养殖企业的迫切需要，因为采用动物试验评价饲用酶的有效性耗时、费力、变异大，试验结果误差较大[34]等缺点。国内外试图探索快捷、易标准化的体外法评价饲用酶的有效性。Alabi等[35]采用胃蛋白酶-胰液素体外两步法评价Roxazyme G、木聚糖酶和植酸酶有效性，试验结果发现体外评价法可用于动物试验的预实验。Kong等[36]分别用胃蛋白酶-胰液素两步法和胃蛋白酶-胰液素-微生物三步法研究了木聚糖酶、蛋白酶和植酸酶组成的混合酶对9种不同来源的饲料原料体外回肠和全消化道干物质消化率的影响，结果发现外源酶对体外干物质消化率和作用受饲料原料和研究方法的影响。Malathi等[37]利用两步法评价木聚糖酶混合酶对常见鸡饲料原料非淀粉多糖消化率的影响，并提出体外法是快速评价外源酶有效性和稳定性的方法。传统体外法的广泛应用常常受到模拟消化酶来源和浓度变异大、体外参数设置缺乏理论解释等因素的制约[38]。

基于单胃动物仿生消化系统的仿生法在“标准化、仪器化、自动化”等方面具有较大的优势，保证了试验结果的准确性和精确性[39-41]。动物营养学国家重点实验室建立了猪禽饲料生物学效价的仿生学评价方法[39-42]，该仿生法与动物试验法测定的干物质消化率、能量消化率、代谢能等之间具有较强的相关性[43-46]，并且精度高，可预判外源酶的有效性[47]，为饲料企业和养殖企业获得外源酶最适添加量，并可利用仿生法筛选猪禽饲料的最佳酶谱[48-49]。本研究采用单胃动物仿生消化系统的仿生评价方法开展了评判耐热植酸酶效率的指标：在体外仿生模拟胃肠消化液中酶活留存率、体外仿生消化法中植酸磷的磷释放量，并建立基于饲料实际调制制粒条件下的水浴法，对耐热植酸酶的有效性进行评估，检测植酸酶酶活留存率，得出单位酶活磷释放量，为饲料企业和养殖企业在实验室中评判及筛选使用耐热植酸酶提供了方案和数据支撑点；体外仿生条件下，依据耐热植酸酶酶解豆粕植酸磷释放磷量(g/t)、干物质消化率提高值(%)、酶水解物能值提高值(MJ/Kg)得出最佳酶活添加量，指导饲料企业和养殖企业确定最适添加量。该仿生法的灵敏度与排空强饲法相比灵敏度高、检测项更低，其高精度和低变异度可用于评定外源酶制剂的作用。

4 结论

本试验条件下，各耐热植酸酶用水浴法(3 min 90 ℃)后测得留存酶活和生产实际85 ℃调制制粒的留存酶活基本一致，差异不显著(P>0.05)，故用水浴法(3 min 90 ℃)评估生产实际调制制粒后的耐热植酸酶酶活留存率是可行的。根据耐热植酸酶在体外仿生系统模拟胃肠消化液中的酶活留存率、体外仿生消化法中植酸磷的酶解磷释放量、水浴法模拟高温制粒过程中的酶活留存率等指标，得出单位酶活释放磷量是评判耐热植酸酶适宜指标。本试验采用的单胃动物仿生消化系统各指标确定耐热植酸酶的最适添加量，可为实验室评价饲用耐热植酸酶的有效性提供方法参考。