王梦飞，朱 红，焦宏亮,周 华，蔡 恒

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800)

ROS作为信号因子调控细胞多个代谢过程，同时它又是造成氧化损伤的“罪魁祸首”。因此，细胞内ROS水平的稳态受多种途径严格控制。为维持ROS处于较低水平，细胞发展了酶系和非酶系两大类抗氧化途径：酶系包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶与硫氧还蛋白过氧化物酶(PRX)等[9]；非酶系如抗坏血酸(Vc)、还原型谷胱甘肽(GSH)以及一些微量元素(Se、Zn等)。哺乳动物和酵母抗氧化反应是相似的，且酵母基因表达调控和信号转导机制与高等生物具有高度同源性，被人们视为现代分子和细胞生物学中的真核模式生物[10]。

随着测序技术日益发展和研究的深入，更加方便科研工作者对具有优良抗逆性的野生酵母进行基因挖掘。本研究中，笔者以一株从自然界筛选获取的具有较强抗氧化能力的酵母为研究基础，对其进行菌种鉴定及性状检测，随后通过RNA-seq技术研究外源添加H2O2诱导的氧化胁迫对该酵母基因表达转录的影响，以深入了解该酵母抗氧化能力优良的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NCY33，一株具有较强抗氧化能力的野生酵母，以H2O2为筛选物从自然界获取。酿酒酵母BY4741(MATa;his3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

酵母培养使用YPD培养基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L；固体加入20 g/L琼脂，如有需要加入不同浓度H2O2。121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 酵母的分离

从含有2 mmol/L H2O2的YPD培养基内获取3株活力最强的酵母，测定抗脂质过氧化能力[11]及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)降解率[12]，将抗氧化能力最强的一株命名为NCY33，以酿酒酵母BY4741为参照对象，在含不同浓度H2O2的YPD平板上30 ℃培养3 d，拍照记录。

1.2.2 菌种鉴定

使用内转录间隔(ITS)序列对该菌株进行菌种鉴定，引物使用 ITS-1与ITS-4[13]。以NCY33总DNA为模板进行PCR，产物经纯化后送至南京金斯瑞公司完成测序。使用BLASTN搜索识别物种(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用MEGA5.0构建菌株进化树，完成菌种鉴定。

1.2.3 酵母氧化胁迫处理

NCY33单菌落接入10 mL YPD液体培养基内，30 ℃、200 r/min摇床培养过夜，制备种子液。以2%(体积分数)的接种量，将种子液接入50 mL YPD液体培养基内，30 ℃、200 r/min培养至对数中期(OD600为0.6～0.8)。加入H2O2，终浓度为4 mmol/L，为实验组(test)。空白组(blank)不加H2O2，培养30 min，离心收集菌体。

1.2.4 RNA的分离与检测

使用Yeast RNAiso kit(TaKaRa公司)试剂盒提取总RNA。每组3个平行样。使用1%琼脂糖进行凝胶电泳分离鉴定；使用NanoPhotometer®分光光度计(Implen公司)检测RNA纯度；利用QuIT®RNA检测试剂盒通过Qube®2 Flurometer(Life Technologies公司)测量RNA浓度；使用安捷伦2100(Agilent Technologies公司)检测RNA样品的RNA 完整(RIN)值。

1.2.5 转录谱测序

利用磁珠富集mRNA，片段化后进行逆转录。双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头，最后进行PCR扩增并纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，随后使用Agilent 2100对文库进行测序。

1.2.6 转录组数据分析

测序所得的原始数据称为原始测序序列(raw reads)，里面含有带接头的、低质量的reads,需要对其过滤，获得clean reads。由于未找到合适的参考基因组，因此在获得clean reads后，采用Trinity对clean reads进行denove拼接获取参考基因。采用RSEM软件(默认参数)将clean reads与拼接得到的参考基因进行比对，统计clean reads在参考基因组上的覆盖度,得到每个样品对应到每个基因上的readcount数目并进行RPKM(reads per kilobase transcriptome per million mapped reads)转化，分析基因的表达水平(在本文中，RPKM>0.3的基因被认为是表达的)。使用DESeq(筛选阈值padj<0.05)进行分析，获取表达差异基因并制备火山图。使用R软件中的聚类软件包pheatmap进行层次聚类分析。最后进行GO富集分析及KEGG富集分析，完成基因功能注释及代谢途径注释。

1.2.7 统计分析

使用SPSS19.0统计软件对DPPH降解率及抗脂质过氧化能力进行数据分析，每组数值采用均数±标准差表示。多组间均数采用单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05认为差异有显著性。使用Origin 8.0完成作图。

2 结果与讨论

2.1 菌株抗氧化能力的检测

DPPH·是一种稳定有机自由基，在517 nm处有一强吸收峰，可用来检测某种物质的抗氧化能力。丙二醛(MDA)是脂质过氧化物的降解产物，其含量在一定程度上可间接反映物质的抗氧化能力。测定菌体密度为108cfu/mL时，菌液的DPPH·降解率和抗脂质过氧化率，结果如图1所示。

由图1可知：初筛获得的3株菌，DPPH降解率分别为38.60%±1.91%、30.88%±1.54%和26.40%±1.32%，抗脂质过氧化率分别为67.15%±3.22%、53.34%±2.66%和40.78%±2.02%。其中，菌1抗氧化能力最强(p<0.05)，将其命名为NCY33。

图1 3株菌对DPPH·降解率及抗脂质过氧化能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ratio and anti-lipid peroxidation ability of three strains

NCY33与BY4741在不同浓度H2O2下的生长情况见图2。

图2 BY4741、NCY33在不同浓度H2O2下的生长情况Fig.2 Growth of BY4741 and NCY33 with H2O2

由图2可知：与正常情况相比，2 mmol/L H2O2对两株菌基本无影响；在4 mmol/L H2O2处理条件下，两者生长明显受到抑制，但与BY4741相比，NCY33受到影响较小；在6 mmol/L H2O2处理条件下，BY4741完全无法生长，而NCY33仍能少量生长。因此NCY33抗氧化能力要高于BY4741。

2.2 NCY33的菌种鉴定

ITS序列经南京金斯瑞公司测序后，使用BLASTN及MEGA 5.0构建出菌种进化树(标准标尺为0.02)，结果见图3。

由图3可知，该酵母为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

图3 菌株NCY33基于ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on partial ITS sequences of NCY33

2.3 RNA样品质量检测

使用1%琼脂糖凝胶电泳对RNA样品进行检测，结果如图4所示。由图4可知，18S rRNA与25S rRNA条带清晰明亮，无拖尾。RNA样品的纯度、浓度以及完整性(RIN值)详情见表1。由表1可知，OD260/OD280均为2.0～2.2，RIN值为6.9～8.9。这6个RNA样品质量合格，可用于后续转录谱测序。

图4 NCY33总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of total RNA from NCY33

表1 RNA样品整体质量Table 1 RNA sample overall quality

2.4 测序数据质量评估

测序所得的原始数据称为raw reads，需对其进行过滤，获得clean reads，结果见表2。由表2可知，经过滤后，每个样品获得超过4G数据，其中Q30的clean reads占总体的91%以上。样品GC含量基本相同，基本维持在39.5%左右。数据质量良好，可用于后续分析。

表2 样品测序数据统计Table 2 Statistics of sample sequencing data

2.5 参考序列的拼接及比对

由于该菌株测序结果与已公布的多个酵母的基因组配对率较低，仅为10%左右，因此本研究将对测序结果进行无参分析。将clear datas与拼接得到的参考基因进行比对，结果见表3。由表3可知，这6个样品的比对率均超过87%，数据符合要求(比对率(mapping rate)>80%)，可进行下一步分析。

表3 Reads与参考序列比对情况一览表Table 3 Reads and reference sequence comparison list

2.6 差异表达基因的筛选

使用DESeq(阈值padj<0.05)筛选差异表达基因，结果见图5。由图5可知，在4 mmol/L H2O2诱导的氧化胁迫环境中，NCY33共有2 387个基因出现显著的差异表达，其中有1 286个上调(红色)，1 101个下调(绿色)。

注：横坐标代表表达倍数变化；纵坐标代表差异显著程度图5 实验组与空白组之间的差异表达基因Fig.5 Differential expressed genes between test and blank

2.7 差异表达基因GO富集分析

为获得基因的功能信息，使用GO数据库完成基因注释，包括同源蛋白注释，结果见图6。基于序列同源性，所有识别到的基因可以通过一些共同的生物学特性而被归类。根据GO功能大致可分为生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大类29分支。由图6可知，生物过程中，主要是细胞代谢过程、有机物代谢过程、单细胞生物过程和初级代谢的基因发生变化。细胞组分中，差异基因主要集中于细胞质以及膜结构方面，另外，所有参与蛋白酶体的基因全部上调。分子功能中，参与有机环化合物结合、杂环化合物结合、离子结合的基因大多差异表达。

图6 NCY33在氧化胁迫下的差异表达基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of the differential expressed genes of NCY33 under oxidation condition

2.8 氧化应激耐受的代谢途径

H2O2诱导的氧化胁迫导致胞内多种代谢途径发生明显改变，图7展示了富集途径中变化最明显的20条代谢途径。在此基础上，为详细了解该酵母的抗氧化机制，笔者将从多个方向进行深入解析。

图7 KEGG pathway富集散点Fig.7 KEGG pathway enrichment scatter plot

2.8.1 抗氧化系统

图8 抗氧化酶基因转录变化Fig.8 Transcriptic changes of antioxidant enzymes under H2O2

2.8.2 DNA修复途径

ROS会对基因造成多种损伤，包括碱基氧化、碱基位点脱落和DNA链断裂[18]。ROS造成的损伤主要是通过碱基切除途径进行修复，且该途径分为短片段和长片段两种[19]。图9为碱基切除修复途径中基因转录的变化情况。由图9可知，涉及长片段修复途径的差异基因全部上调，ALKA编码的3-甲基腺嘌呤糖基化酶Ⅱ识别受损碱基，将其切除形成AP位点，该位点被AP核酸内切酶(未检测到变化)处理，形成核苷酸缺口[20]，在POLE1、POLE2和POLD1、POLD2编码的4个亚基构成的DNA聚合酶作用下完成修补。但是多个核苷酸的连接导致原DNA 链以单链悬臂或者帽子结构暴露出来，这就需要FEN1编码的皮瓣内切酶将其切除。最后在Lig1编码的DNA连接酶的作用下连接DNA片段，完成修复。PCNA编码的增殖细胞核抗原起到调控DNA聚合酶的作用。而在短链BER途径中，编码DNA-甲氨基嘧啶糖基化酶的FPG和编码内切酶3的NTH转录水平均下调，这一结果将限制短链BER途径的效率，其原因可能在氧化胁迫下，DNA发生大规模损伤，而短链修复途径效率过低，细胞此时主要依赖于长链途径对受损DNA进行高效修复。

图9 碱基切除修复途径中基因转录变化情况Fig.9 Transcriptic changes of genes in base excision repair

2.8.3 错误蛋白的降解途径

ROS直接对蛋白质进行修饰，可造成DNA突变和MDA(丙二醛)的产生，间接引起蛋白质错误折叠并聚集。细胞通过泛素化-蛋白酶体系统(UPP)和自噬途径清除错误蛋白。泛素化-蛋白酶体途径需要Ube1(泛素活化酶E1)激活泛素(Ub)，在其甘氨酸残基和半胱氨酸残基的活性位点处形成一个硫脂键，Ube2(泛素结合酶)通过硫脂键反应获得激活的Ub，随后Ube3(泛素连接酶)引导激活的Ub从E2转移到蛋白底物，这些被泛素标记的蛋白底物在26S蛋白酶体中降解[21]。图10为涉及蛋白质降解途径的多基因的转录变化情况。由图10可以看到，UBE1、UBE2和3种UBE3转录水平均升高，蛋白酶体内的多个RPN与RPT调节亚基以及PSM组成亚基转录水平均升高了1倍以上，泛素化-蛋白酶体途径整体增强。细胞内80%以上蛋白质都是由泛素化-蛋白酶体途径完成降解[22]。当蛋白质聚集体过大时，蛋白酶体无法将其降解，细胞启动自噬途径进行清除[23]。本实验中ATG1、ATG11、LC3转录水平发生上调。ATG1是自噬途径的调控基因，控制着自噬的启动。Atg11作为选择性自噬中的适配蛋白,协助受体蛋白将目标蛋白运送至降解位点[24]。LC3编码γ-氨基丁酸(A)受体相关蛋白，其活性直接影响形成自噬体的数量[25]。自噬的适度增强不仅可清除受损蛋白质与细胞器，还可为细胞的生命活动提供能量与原料。在人体中，迄今已发现20多种蛋白质的错误折叠与诸多神经退性疾病有关，如AD、PD、亨廷顿病(HD)和肌萎缩侧索硬化(ALS)等[26]。如何增强人体清除错误蛋白的能力，是治疗多种神经退性疾病的一大方向。以酵母作为生物模型，通过研究氧化胁迫下，该酵母参与降解错误蛋白的主要途径及关键基因，进一步了解降解机制，为治疗神经退性疾病提供新靶点。

图10 涉及蛋白质降解途径的多个基因变化情况Fig.10 Transcriptic changes of genes relating to protein degradation

2.8.4 能量合成途径

能量是生物进行生命活动的基本要求，真核需氧生物利用葡萄糖通过糖酵解、三羧酸循环(TCA)、氧化磷酸化以及脂肪酸氧化途径产生能量，在氧化胁迫环境中，这些途径均发生变化。图11为能量合成途径中多个关键基因的转录变化情况。由图11可知，在氧化胁迫下，该酵母糖酵解上游多个基因发生下调，如HK(己糖激酶)、GPI(6-磷酸葡萄糖异构酶)基因，而磷酸戊糖途径中2个限速酶G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、PGD(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)明显上调，其结果是葡萄糖将主要进入磷酸戊糖途径进行初步代谢，最终生成3-磷酸甘油醛重新进入糖酵解，随后在PGAM(磷酸甘油酸变位酶)、ENO(烯醇化酶)和PK(丙酮酸激酶)等酶的作用下生成丙酮酸。这一变化既减少了ATP的消耗又产生了大量NADPH用于抗氧化过程。在脂肪酸β氧化过程中，除编码酰基辅酶A脱氢酶的ACADM外都发生明显下调。ACOX编码脂酰辅酶A氧化酶催化脂酰辅酶A脱氢后，与O2结合生成H2O2而不是H2O[27]。细胞可能为避免更多H2O2的生成主动减弱该过程的进行。在三羧酸循环中，基因表达变化的结果将导致α-酮戊二酸积累，α-酮戊二酸可直接参与H2O2的清除，同时也能增强谷胱甘肽的合成增加抗氧化能力[28]。另外，在电子传递链中几乎所有差异基因均发生下调，尤其是编码复合体Ⅰ和复合体Ⅲ亚基的基因(数据未显示)。二者均是ROS的主要产生位点[29]，这可能与ACOX下调的原因一致。在氧化胁迫下，该细胞通过对代谢的整体调控，维持胞内代谢的基本运行，避免ROS大量产生的同时，保证ATP的基本供应，产生大量的[H]用于清除ROS，保证细胞能够在氧化胁迫下继续存活。

图11 能量合成途径多个关键基因变化情况Fig.11 Transcriptic changes of genes participating in energy synthesis

3 结论

从自然界中筛选得到1株DPPH降解能力及抗脂质过氧化能力分别为38.60%±1.91%、 67.15%±3.22%且可耐受6 mmol/L H2O2的德巴利汉逊酵母，命名为NCY33。该酵母在H2O2诱导的氧化胁迫下，共有1 286个基因转录水平上调，1 101个下调。通过对可能会影响细胞抗氧化能力的途径进行分析发现：该酵母处于氧化胁迫下，调整能量代谢方式，在维持能量供应的同时避免ROS的产生；增强抗氧化系统，用于清除ROS；增强自噬及泛素化途径，清除错误蛋白；提高碱基切除修复系统对受损DNA进行修复。