丁锐 陈旭辉 李炳学

（1. 沈阳农业大学土地与环境学院，沈阳 110866；2. 沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳 110866）

磷是植物生长发育必需的营养元素，同时也是许多国家农业生产重要的限制因素。从世界范围来看，土壤中的总磷含量较丰富，但95%以上都以无效磷的形式存在而不能被植物吸收利用，因此施加外源磷肥一直被作为农业生产中维持作物产量的重要手段［1］。然而，作物对磷肥的利用率较低，大部分磷肥施用后会迅速与土壤中的物质发生磷的固定，形成难溶性的磷酸盐而累积在土壤中［2］。长期持续施用磷肥不但会造成磷矿资源的巨大浪费，同时也容易引起土壤板结、酸化、面源污染及水体污染等一系列生态问题［3］。要想解决土壤中磷素的限制问题，根源在于解决磷的利用问题，提高土壤中磷素的利用率对可持续农业的发展具有战略意义［4］。

植酸是土壤有机磷的主要形态，也是植物生长所需磷素的重要供给源之一［5-7］。植酸中固定的磷不能被植物直接利用，需要降解为无机磷酸根后才能被植物吸收。土壤中植酸的降解属于酶促反应，主要依靠土壤微生物产生植酸酶，因此植酸酶在自然界磷素循环中起着重要作用。目前，关于饲用植酸酶已有深入研究并得到了广泛应用，而有关土壤植酸酶及其对土壤有机磷转化作用的研究相对较少，其作为土壤改良剂的应用潜力也有待深入发掘。

目前，高通量的宏基因组技术在发掘自然环境中潜在的微生物资源和新型功能基因方面展现出巨大潜力，其优点是不需要进行微生物的纯培养，而是直接从环境样品中提取微生物总基因组DNA即可进行研究［8］。基因组技术的应用标志着植酸酶研究进入一个新时代。本文拟对植酸酶的研究现状进行综述，以及在基因组时代下土壤植酸酶在农业领域的应用前景与面临的挑战进行分析与展望。

1 植酸酶的分类及性质

植酸酶属于磷酸单脂水解酶类，可以催化植酸水解脱掉磷酸基团，是一种胞外酶。植酸酶广泛分布于自然界中，在动物、植物和微生物中都有发现［9-11］，土壤中的植酸酶主要由土壤微生物分泌产生。植酸酶种类丰富，其结构和性质差异较大，催化机理也各不相同。根据植酸酶的最适pH可将其分为碱性植酸酶和酸性植酸酶，真菌以及绝大多数的细菌和植物可分泌酸性植酸酶，而少部分细菌和植物能产生中性或偏碱性植酸酶［12］。根据植酸酶催化机理的不同可将其分为4类［13］，一是组氨酸酸性植酸酶（Histidine acid phosphatase，HAP），是多数真菌和肠杆菌来源的植酸酶，目前应用较广泛；二是β-螺旋植酸酶（β-propeller phytases，BPP），该类植酸酶主要来源于芽孢杆菌并具有较好的热稳定性；三是半胱氨酸植酸酶（Cysteine phosphatase，CP），目前仅在瘤胃微生物中发现；四是紫色酸性植酸酶（Purple acid phosphatase，PAP），在哺乳动物、植物、真菌和细菌中广泛分布。

植酸酶的活性受环境pH、温度等因素影响。研究发现，不同来源植酸酶的最适pH差异较大，细菌植酸酶最适pH一般为中性或偏酸性，而真菌植酸酶一般为2.5-7.0，大部分植酸酶的最适pH在4.0-7.5之间，在pH＜ 3.0时植酸酶活性显著下降甚至完全失活［9，13-14］。一般来说，植酸酶在50-70℃的范围内都具有高活性，多数情况下其活性在45-60℃范围内较稳定，更高温度下容易失活。

2 植酸酶基因多样性

植酸酶基因主要分为动物、植物和微生物3种不同来源，已被研究的植酸酶大多数来源于微生物，如大肠杆菌、假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌以及酵母属、曲霉属、梨形毛霉、少孢根霉和枝孢霉属等真菌［15-16］。迄今为止，被分离并克隆的植酸酶基因已经达到了几十种，有相当一部分实现了异源表达并进行了酶学性质检测［17-20］，其中来源于微生物的植酸酶基因主要包括：来源于真菌的phyA（B）基因、来源于芽孢杆菌的phyC（L）基因、来源于大肠杆菌的appA基因。

研究表明，植酸酶基因的同源性越高，其序列相似性往往也越高。Mukhametzynova等［13］比较了NCBI数据库收录的所有芽孢杆菌phyC基因，发现其序列相似性极高，该结果同时也在曲霉属真菌不同物种的phyA基因中被证实，曲霉属的phyA基因无论在核苷酸来源、编码的氨基酸序列等基因结构上，还是在基因产物的酶学特性上均具有较高的相似性。与真菌来源的植酸酶相比，来源于细菌的植酸酶的编码基因较短，编码蛋白的分子量也较小，与来自真菌的植酸酶基因几乎没有同源性［13，21］。此外，细菌来源的植酸酶通常具有较高的酶活性，但其热稳定性和pH耐受性相对较差［21］。

随着研究的不断深入，近年来已有越来越多的新型植酸酶基因被克隆和鉴定［22-26］，为发掘和利用自然界潜在的植酸酶资源以及研究新型功能基因奠定了基础，其中高热稳定性、高耐酸性植酸酶基因是当前研究的重点。利用基因工程手段定点突变植酸酶基因使其定向进化，也是一种获得高稳定性植酸酶的方法。通过对影响植酸酶热稳定性、最适pH、活性氨基酸残基进行研究，并通过基因工程改造获得优良的植酸酶是该领域研究的发展趋势［27］。

3 植酸酶的获取技术

为了获取在某个特定领域有应用价值的植酸酶，最初人们通过原酶的蛋白纯化进而研究酶的性质［28］。随着宏基因组技术的广泛应用，酶的分子生物学研究有了很大进展，植酸酶基因的分子克隆变得越来越容易［29］。Huang等［30］利用宏基因组技术发现草鱼肠道内具有很高的植酸酶基因多样性，其中β-螺旋植酸酶是草鱼肠道环境的优势植酸酶，且该酶基因大部分都来自于不可培养的细菌类群。Huang等［31］通过构建波尔山羊和荷兰牛瘤胃微生物的宏基因组文库，研究了瘤胃植酸酶基因的丰度、多样性及酶特性，共得到101个半胱氨酸植酸酶基因并筛选出一个具有植酸降解能力的新型基因。Tan等［25］构建了农田土壤的宏基因组文库，利用功能基因筛选的方法获得了两个新型植酸酶基因，其中一个植酸酶的编码基因属于组氨酸酸性植酸酶家族，而另一个植酸酶则由多个开放阅读框共同编码，不同于目前已知的所有植酸酶家族，该植酸酶展现了较强的植酸降解能力，其作用机制及应用潜力有待深入研究。Farias等［32］通过构建红米秸秆残留物和蓖麻饼的宏基因组文库并采用功能基因筛选的方法获得了一个新型β-螺旋植酸酶基因，该重组植酸酶在中性pH条件下具有较强的催化活性，揭示了其在饲料添加工业中具有潜在应用价值。Zhang等［26］利用宏基因组技术研究了深圳湾红树林根围沉淀物的细菌群落多样性，从中分离获得29个产植酸酶的可培养菌株，分析了它们的植酸降解能力和系统发育关系，并筛选获得一个具有较强植酸降解能力的菌株。

4 提高植酸酶产率的策略

植酸酶的生产目前主要采用微生物发酵的方法，但原产植酸酶的微生物大多数不适合大规模发酵培养，因此，通过基因工程技术手段将植酸酶基因转入适当的菌种使其高效表达，从而构建植酸酶高产菌株已成为植酸酶研究的发展趋势，在合适的宿主中克隆和表达植酸酶基因可以进一步提高植酸酶产量［33］。目前，植酸酶基因已经在多种表达系统中成功表达，如大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的原核表达系统［26，30，34］、巴斯德毕赤酵母的真核表达系统以及玉米、拟南芥、水稻、烟草等植物表达系统［34-37］。例如，姚斌等［34］将从Bacillus subtilis中分离出的中性植酸酶基因克隆入大肠杆菌，IPTG诱导获得了高效表达的植酸酶。Ushasree等［18］成功克隆了Aspergillus niger中的植酸酶基因并将其在大肠杆菌中进行共表达。Chen等［35］将大肠杆菌的植酸酶基因appA融合AOX1启动子，在巴斯德毕赤酵母中实现了高效表达，高密度培养后胞外植酸酶的产量达到5000 U/mL。Hong等［36］发现大肠杆菌的植酸酶基因可以在萌发的水稻种子中表达，酶活性比原菌株提高60倍，且对水稻植株的生长没有任何影响。

此外，天然植酸酶的一些性质可能不完全适合实际生产的要求，如抗逆性、有效性等，特别是植酸酶的热稳定性，而利用基因工程技术手段在分子水平上对基因进行遗传改造，则有望使这些性质得到改善［37-38］。在技术上，通常采用点饱和突变技术对植酸酶编码基因进行改造，诱使其定向进化，从而在短时间内获取大量突变子，并筛选符合生产需求的植酸酶［39］。目前已经产业化的植酸酶大多是通过这种方式获得，然而由于该方面的研究仅仅针对极少数的原酶基因展开，大大限制了植酸酶产业的进一步发展，今后有必要加强对更多的植酸酶基因进行相关研究，扩大植酸酶基因的选择范围。随着基因工程技术的不断发展，构建高产、高活性及高稳定性的产植酸酶基因工程菌株，植酸酶的应用必将越来越广泛。

5 植酸酶在农业领域的应用

目前植酸酶主要应用于饲料加工业，作为一种高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂使用［9］。此外，植酸酶也可以应用在食品工业及农业领域［40］。相比较而言，植酸酶在农业领域的研究略显薄弱，研究内容主要集中在两个方面。

一方面是向土壤中施加外源植酸酶或可产生植酸酶的菌种作为土壤改良剂，研究其对土壤有机磷转化及植物生长发育的影响［41］。例如，Gujar等［42］研究发现，植酸酶的施加可以减少土壤中大约30%的植酸，使有效磷含量提高1.18倍，且施加植酸酶土壤中水稻的生长状况优于对照组。苏毅等［43］研究发现，施加外源植酸酶能够显著增加黄瓜苗的株高、玉米苗的干重和株高以及茼蒿苗的叶绿素含量，且3种植物幼苗的生长状况与植酸酶的添加量呈显著正相关。曲博等［44］研究了施加外源植酸酶对湿地土壤有机磷组分含量变化的影响及各组分随时间的变化规律，发现添加外源植酸酶可以在短期内提高土壤有机磷的有效性，促进稳定性有机磷向活性有机磷转化，其作用效果与植酸酶添加量及培养时间呈显著正相关。类似的研究报道还有很多，从这些研究结果可以看出，外源植酸酶在大多数情况下可以促进磷的转化，且作用效果主要受到植酸酶添加量的影响［45-47］。与此同时，植酸酶的作用效果同时也会受到植酸酶种类的影响［14］。自然界植酸酶类型多样，催化机理各不相同，不同种类的植酸酶的作用效果可能会有很大差异。此外，目前的研究中所施加的外源植酸酶大多来源于通过基因工程技术定向改造的适用于动物饲料加工产业的植酸酶产品，其在土壤环境条件下能否发挥最大效能并不可知，若仅仅依靠增加添加剂量来提高作用效果势必会造成使用成本的极大提高。

另一方面是将植酸酶基因转入植物体内构成转基因植株，研究其对土壤磷素转化的影响。目前该方面的研究在玉米［48-49］、拟南芥［50］、棉花［51］、烟草［52］及豆科某些植物［53-54］中进行。研究发现，转入植酸酶基因的玉米可显著提高根际土壤植酸酶活性，增加植株对土壤有机磷的吸收，提高磷素利用率［49］，而植株分泌的外源植酸酶可能是提高土壤磷素利用率的主要因素［55］。但转植酸酶基因作物的安全性问题一直是植酸酶植物基因工程面临的重要问题，将来能否用转基因植物大规模生产植酸酶，还取决于人们对转基因植物的认可以及产品的成本。

6 展望

植酸酶作为植酸降解过程中的关键酶，已被广泛应用于经济动物的饲料添加及人类的食品加工等领域，能够显著提高动物对植酸磷及矿质元素的吸收效率，降低排泄物中的磷含量从而降低自然生态系统中的磷污染。然而，植酸酶作为土壤酶肥料的研究及在农业领域的应用却远远落后。植酸酶在土壤磷素循环中起着重要的生物催化剂的作用，研究表明向土壤中添加外源植酸酶可以显著提高土壤磷的利用率，并显著影响土壤稳定性。因此，在磷肥全球需求不断增长的大环境下，发掘自然界蕴藏的丰富的植酸酶资源，合理利用其作为环境友好型的酶制剂对减少土壤磷肥的施用量将具有战略意义。

植酸酶在农业领域具有极大的应用潜力，然而迄今为止，农用型的植酸酶产品的深度开发还是空白，市场上还没有植酸酶相关的土壤改良制剂或生物肥料，人们对植酸酶在农业领域的应用还需要一个逐渐认识的过程。已有研究表明，土壤中含有丰富的植酸酶基因资源，然而目前有关土壤植酸酶资源发掘及利用的研究较少［24-26］。土壤中植酸酶的有效性和稳定性可能受到土壤理化性质及土壤微生物类群等多种因素影响，然而目前对这方面的认识还远远不够［40］。鉴于此，今后的研究可以集中在以下几个方面：（1）利用高通量的宏基因组技术开展我国土壤植酸酶的种类、多样性及酶学性质研究，发掘其作为土壤改良剂的应用潜力；（2）优选高活性的植酸酶菌种或重组载体，检测其在土壤中的有效性、稳定性及影响因素；（3）对具有开发潜力的植酸酶基因进行基因组分析和遗传分子改造［56］，提高植酸酶工程菌的发酵产量，选育适合土壤环境的性质优良的植酸酶工程菌株；（4）适合土壤环境的植酸酶菌制剂的开发和研制。