郭腾，商琰红，李小芳，贾友超，王晓芳

河北大学附属医院 河北省肿瘤放化疗机制与规程研究重点实验室 河北大学临床医学院，河北保定071000

免疫治疗在一定程度上改善了非小细胞肺癌(NSCLC)患者的结局，但现阶段靶向治疗仍是驱动基因阳性患者的主要治疗手段，而精准的基因分型是精准靶向的基础。美国临床肿瘤学会(ASCO)指南推荐，表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、ROS1受体酪氨酸激酶(ROS1)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B(BRAF)驱动基因的分子状态应作为常规独立检测，如上述结果均正常或样本充足，还应对RET、人表皮生长因子受体2(HER2)、鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、间质上皮转化因子(MET)等驱动基因进行检测，寻找有效靶点。由于肿瘤的异质性，不同个体间药物疗效存在差异；而疗效预测标志物有助于对患者进行分层、预估疗效，及时予以干预。靶向药物效果虽好，但随着时间推移及治疗方案的变化，肿瘤细胞持续进化，最终不可避免地会出现耐药。因此，对耐药患者进行二次甚至多次检测，评估和跟踪肿瘤生物学变化，有助于改善预后。肿瘤组织是临床上最常选取的检测材料，但实践中受多种原因限制，导致肺癌组织标本检测率并不高，也不适合对基因型连续监测，因而基于驱动基因变异靶点的个体化治疗策略难以实施。由此，精准医学的重点正日益转向液体活检，其中循环肿瘤DNA(ctDNA)作为生物标志物的能力被广泛研究。ctDNA在NSCLC患者EGFR检测中的临床效用和实用性已被证实，并被批准用于指导EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)靶向治疗的选择。因此，本文就ctDNA在驱动基因阳性NSCLC疗效预测及耐药机制探索的研究综述如下。

1 EGFR

我国大陆地区晚期NSCLC患者中，EGFR总突变率为50.2%，EGFR激活突变率为48.0%，是我国NSCLC患者最常见、最重要的驱动基因突变类型。

1.1 疗效预测 对于EGFR突变阳性患者，EGFR-TKIs有效率﹥70%，但不同个体间疗效和预后存在差异。疗效预测标志物有助于临床判断药物疗效，并预测病情走向。

近期Iwama等[1]针对组织检测EGFR突变阳性的Ⅲ、Ⅳ期NSCLC患者进行了一项多中心、前瞻性的研究，该研究通过分析患者基线及EGFR-TKIs治疗期间直至疾病进展的血浆ctDNA发现，EGFR激活突变在12周或24周清除的患者中位无进展生存期(PFS)较同时点突变仍可检测到者大大延长，36周检测EGFR激活突变增加的患者中位PFS更短。这证实了ctDNA EGFR突变状态的动态变化对TKIs疗效有预测作用。在不同研究中，具有疗效预测作用的ctDNA检测时点存在差异，这可能与ctDNA检测技术或标准不一致有关。Marchetti等[2]研究发现，TKIs治疗14 d后EGFR半定量指数下降率≥50%的患者，在治疗2个月时肿瘤缩小百分比大于EGFR突变水平下降率<50%者，表明对ctDNA中EGFR突变进行定量也有助于预测疗效。

伴随着三代EGFR-TKIs相关研究的逐渐深入，T790M突变用于预测TKIs疗效与疾病进展的观点逐渐出现[3]；但其作为一种亚克隆突变的突变水平远低于EGFR，不能代表EGFR整体状态，故单独监测T790M清除作为治疗预测因子可靠性差。考虑到EGFR突变状态作为预测因子的稳定性，T790M/EGFR激活突变可能更适合用于奥西替尼疗效预测[4]。Oxnard等[5]对奥西替尼治疗耐药后患者血浆ctDNA进行分析，发现耐药时T790M突变清除患者中位治疗停止时间(TTD)更短；进一步研究表明，T790M突变清除患者预先存在耐药克隆，并出现了早期耐药，而晚期耐药的患者则更有可能维持T790M并获得C797S突变，表明T790M及EGFR突变水平改变情况可用于预估耐药模式、预测疗效。

Buttitta等[6]在奥西替尼治疗病情进展患者血浆中发现多种耐药改变，而在奥西替尼治疗1个月、EGFR激活突变未清除患者血浆中也检出了这些耐药改变，包括MET和HER2基因扩增、KRAS和PIK3CA基因突变，表明这些耐药诱导突变已存在肿瘤细胞中，再次证实了ctDNA在发现早期耐药及疗效预测方面的潜力。该研究团队提出，如治疗第15、30天，EGFR激活突变未完全清除或显著降低，则建议行大规模平行测序进行血浆评估，根据情况修改治疗方案。而早期发现耐药机制中相关的突变，对于患者选择特定治疗方案可能很重要，因药物联合治疗双突变或多个突变患者有效。

此外，在EGFR-TKIs治疗期间，ctDNA EGFR激活突变阳性的等位基因数量增加发生在疾病进展前或进展时[1]，EGFR耐药突变的动态变化可能早于放射学结果，显示了影像学进展前动态监测ctDNA EGFR突变对EGFR-TKIs治疗反应的预测价值。这对调整治疗方案的时机提出了挑战。目前，APPLE-EORTC试验[3]正在对治疗时机的选择进行探索。

1.2 耐药机制 EGFR-TKIs耐药机制是多因素的，治疗期间发现的亚克隆或分支突变可能在患者分层和指导靶向治疗方面具有实用价值。其中一些抗性是可靶向的，但还有一些抗性机制可能目前尚无有效治疗方案，而该机制的发现有助于进一步探索新药。目前已知的耐药机制大多是基于组织活检发现的，但实际上除了组织转化外，已证实的TKIs耐药机制大多在血浆ctDNA中得到了验证[7]。其中EGFR T790M突变最常见于第一、二代EGFR-TKIs治疗后的患者，血浆ctDNA检测T790M突变筛选奥西替尼用药人群已应用于临床。其他耐药机制包括MET、HER2扩增及PIK3CA、PTEN基因异常，基于ctDNA的基因组分析已被用来描述耐药机制。许多通过ctDNA寻找耐药机制并对耐药变化动态监测，以达到辅助临床治疗、延长生存的成功案例已有报道[8]。

FLAURA研究中奥西替尼的良好表现使其进入一线治疗的行列。AURA研究利用第二代测序(NGS)技术在奥西替尼耐药患者血浆ctDNA检测到C797S突变，但未检测到T790M突变，提示奥西替尼作为一线治疗时，可能不产生T790M突变作为其耐药机制[9]。这可能有潜在的重大临床意义，因为喹唑啉类EGFR抑制剂包括吉非替尼等已被证明在T790M缺失时能够有效抑制C797S突变，但在复杂的耐药背景下这种可能性有待进一步研究。其他发现的已确认的基因组耐药机制包括EGFR下游通路(MAPK信号通路)或旁路(MET、HER2)激活，提示一线奥西替尼治疗疾病进展后，联合治疗可能有助于改善患者预后。50%的耐药后血浆样本中未检测到ctDNA，提示部分患者分子改变只能在组织水平检测到或存在其他非基因组相关耐药机制。

如前所述，部分耐药机制在TKIs治疗前即与敏感突变同时存在，可能表现为较小克隆而不易发现；在TKIs治疗后敏感突变减少，原有小克隆成为主要耐药机制。例如1例T790M突变阳性患者在奥西替尼治疗前，在6%的细胞中存在MET扩增；奥西替尼治疗后，在94%细胞中检测到MET扩增，它成为主要耐药机制[5]。在监测三代EGFR-TKIs罗西替尼ctDNA时发现，原有MET、HER2、EGFR基因拷贝水平增高多发生在原发耐药患者中[10]，这可能与早期耐药相关。如果能在早期耐药阶段给予有效处理，将有助于改善患者预后。

此外，ctDNA在发现新的耐药机制方面也有优秀表现。对奥西替尼耐药患者血浆ctDNA进行NGS检测，耐药血浆中检测到EGFR Leu792突变(包括L792F/Y/H)[11]，部分病例中甚至出现了L792F/Y/H 突变等位基因总和(12%)远高于C797S(1%)，成为新获得的主要突变的现象，而此种突变可能与三代EGFR-TKIs耐药相关[12]。EGFR L858R/T790M双突变患者经三线奥西替尼治疗进展后，ctDNA检测到了M766Q突变[13]，该突变也可介导第一、二代EGFR-TKIs的耐药。另外，罗西替尼耐药血浆中发现了新的EGFR L798I突变可能与耐药相关[10]。

部分患者EGFR-TKIs治疗后发生小细胞肺癌(SCLC)转化，难以通过ctDNA检测该耐药机制，给ctDNA用于临床实践带来了挑战。Minari等[14]通过对试验中患者血浆进行EGFR分子检测，认为在T790M/EGFR激活突变比例较低的情况下，应考虑组织活检以排除SCLC转化和其他伴随耐药机制的存在。

2 ALK

ALK重排是2%～7% NSCLC患者的致癌驱动因素。当组织留取困难或不足以进行检测时，通过ctDNA检测ALK指导临床用药的成功案例已被报道。但是，由于PCR很难检测到ctDNA中ALK和ROS1等基因重排事件，ctDNA相关研究进展缓慢。

2.1 疗效预测 多个研究指出，ctDAN ALK变异等位基因改变频率(VAF)变化与ALK抑制剂治疗反应密切相关。2019年ASCO会议上一项研究表明，动态监测ctDNA可以预测劳拉替尼对二代TKIs失败后ALK阳性NSCLC患者的疗效。该研究对57例患者配对血浆样本进行分析，发现用药6周后ctDNA降低与更好的应答反应和更长的PFS有关。

此外，不同靶向药对不同突变敏感性不同；监测ctDNA动态耐药过程，明确耐药改变，有助于预测药物疗效。例如，劳拉替尼对G1202R/del、L1196M、F1174X、G1269A和I1171X等ALK常见耐药突变均具有抗癌活性，但客观缓解率(ORR)从42%～89%。其中，劳拉替尼在G1202R/del和I1171X突变患者中，ORR分别为57%和75%，中位响应持续时间(DOR)分别为7.0个月和4.2个月，中位PFS分别为8.2个月和5.5个月[15]。即使是面对阿来替尼34.8个月的超长PFS[16]，ctDNA在预测药物疗效、发现早期耐药、评估预后等方面都有着重要作用。

2.2 耐药机制 克唑替尼作为一代ALK-TKIs，中位PFS为10.9个月，但不久发现约30%出现原发耐药，部分患者在1～2年内出现继发耐药。为解决克唑替尼耐药问题，一系列ALK抑制剂问世，一定程度上改善着患者的预后，但最终也不可避免地出现耐药。尽管有着共同的分子驱动因素，但在不同靶向药物的压力选择下，患者突变谱不断变化。Shaw等[17]发现，劳拉替尼失败患者可能存在新的突变使其对克唑替尼重新敏感，该发现强调了获得性耐药机制的确定对ALK重排患者争取治疗决策的重要作用。大量基于组织的耐药机制已被证实，但液体活检相关的研究不多。

一项基于血浆ctDNA检测的回顾性分析显示，ALK阳性患者耐药机制主要包括ALK酪氨酸激酶域突变、ALK融合基因扩增、其他信号通路激活[18]。其中，ALK耐药突变种类多样，不同靶向药突变谱可能存在差异，常见耐药突变有G1202R、F1174C/V/L和I1171T/N。二代ALK-TKIs治疗进展后出现的ALK突变多表现为复合突变，与组织检测结果一致[19]。但组织检测结果中，包含复合突变患者所占比例更低，这可能与肿瘤异质性有关，说明ctDNA受异质性影响更小。其他脱靶致癌改变包括KRAS、BRAF、EGFR、MET突变及CCND2、FGFR2、MYC扩增等，但它们在ALK-TKIs耐药中的地位有待进一步研究。Guo等[20]对1例先后接受了一、二、三代ALK-TKIs治疗的ALK阳性肺癌患者进行ctDAN连续收集，发现了MET扩增可能是一种新的劳拉替尼耐药机制，获得性ALK T1151Sins突变可能是一种新的色瑞替尼抗性机制。Hassan等[21]报告了1例克唑替尼、阿来替尼治疗后疾病进展的病例，患者ctDNA提示ALK G1202R突变，给予劳拉替尼治疗，患者中枢神经系统转移灶减小，同时G1202R突变清除，但出现大量心包积液，心包积液石蜡包埋标本检出SCLC转化并伴有ALK融合。另外，还有报道指出ALK阳性患者在阿来替尼治疗后出现鳞状细胞癌转化。再次提醒我们，如果临床可行，组织学检查和基于组织的再次活检仍然是评估耐药机制和指导随后的合理临床治疗的金标准。

3 KRAS

KRAS突变是NSCLC中常见的突变，其在亚洲肺腺癌中突变发生率11.2%，低于西方国家，是在疾病早期即获得的主干突变，也是常见的耐药突变。AMG 510被FDA授予KRAS G12C突变阳性NSCLC孤儿药的资格，MRTX849等多种KRAS靶向药正在进行临床试验，免疫治疗在KRAS阳性NSCLC中也有研究前景。有研究显示，ctDNA KRAS突变状态可作为Onvansertib联合FOLFIRI和Avastin治疗转移性结直肠癌肿瘤突变负荷及治疗反应的早期标志，但ctDNA在KRAS阳性NSCLC的作用有待进一步研究。

一项前瞻性研究收集了32例KRAS突变转移性肺腺癌患者的ctDNA及循环肿瘤细胞(CTC)，并采用微滴式数字PCR(ddPCR)法进行了KRAS突变的检测，发现ctDNA检测灵敏度更高(78%vs34%)[22]，尤其是在多部位转移、肝转移或骨转移患者中[23]，支持ctDNA作为NSCLC分子分析的敏感标本类型。与EGFR、ALK阳性患者一样，ctDNA拷贝数变化与治疗效果具有相关性，这可能与肿瘤负荷改变有关。此外，有数据显示KRAS突变的肿瘤与高突变负荷相关，更有可能表达PD-L1[24]，提示血浆ctDNA监测KRAS有可能在PD1、PD-L1为靶点的免疫治疗中鉴别影像学进展真假提供帮助。

4 ROS1

ROS1常见的致病性改变为基因重排，肺癌患者中只有0.8%～1.7%的患者会发生，目前尚无特异性的ROS1靶向药。由于ROS1与ALK结构的相似性，除阿来替尼外，其他ALK抑制剂多能发挥抗ROS1作用，克唑替尼为一线药物。目前，ctDNA在ROS1靶向药的预测作用未见相关报道。

Dagogo-Jack等[25]通过分析血浆ctDNA发现，ROS1阳性患者克唑替尼耐药后检出ROS1耐药突变，支持ROS1激酶域突变是克唑替尼耐药的重要原因这一观点。ctDNA还可以检测到脱靶导致的耐药，如KIT或KRAS激活。此外，在克唑替尼治疗复发患者的血浆中检测到了BRAF V600E、PIK3CA E545K，但尚不能确认是否与耐药有关。

5 BRAF

BRAF在NSCLC中突变率为1%～3%，多发生在腺癌中，V600E是BRAF基因常见突变位点。目前，针对BRAF致病性突变的药物包括MEK抑制剂和RAF抑制剂。曲美替尼联合达菲替尼是BRAF V600E/K突变阳性患者的标准治疗，免疫治疗也有不错效果。ctDNA在BRAF突变阳性患者的研究主要集中在黑色素瘤方向，NSCLC中相关研究较少。

Guibert等[26]对6例BRAF V600E突变阳性的转移性NSCLC患者进行ctDNA监测，发现血浆ctDNA检测到的BRAF突变拷贝数与患者对BRAF-TKIs的反应有明显相关性，其动态变化与肿瘤负荷也有相关性。进一步对BRAF-TKIs耐药后患者ctDNA进行分析，结果显示突变型与野生型拷贝数的比例与肿瘤负荷存在相关性，表现为肿瘤负荷增大、BRAF突变拷贝减少、野生型增多，提示BRAF突变克隆不再占主导地位。同时，除已知BRAF突变外，还检测到了A132C-IDH1突变，此突变可能参与了BRAF-TKIs耐药机制。

6 MET

MET激活途径包括突变、扩增及蛋白过表达，以MET拷贝数增加和14外显子跳跃突变为主，常受益于MET-TKIs，如克唑替尼、卡博替尼等。其中，MET 14外显子跳跃突变不与EGFR、ALK等驱动突变共存，更可能作为独立致癌驱动基因，存在于1%～3%的NSCLC患者中。1例病案报告显示，ctDNA VAF变化与肿瘤大小变化一致，患者达部分缓解时，MET突变检测阴性[27]。因此，ctDNA可能存在疗效预测的潜力，但仍需进一步研究。Rotow等[28]对晚期MET 14外显子突变患者ctDNA进行测序分析，检测到频繁的RAS-MAPK通路基因改变，如KRAS、NF1。临床前模型证实这些改变促进了MET-TKIs的耐药性产生，以MAPK信号通路为靶点的联合治疗可能改善MET-TKIs耐药患者疗效。

7 RET和HER2

RET重排发生在1%～2%的NSCLC患者中，多种具有抗RET活性的多激酶酪氨酸抑制剂，包括卡博替尼、凡德他尼等都表现了一定的抗肿瘤活性，RET激酶抑制剂，如LOXO-292、BLU-667等也显示了良好前景。2%～4%的NSCLC存在HER2突变，其中90%存在20外显子的插入，目前尚无靶向药获批。吡咯替尼在HER2突变NSCLC中显示出良好安全性和抗肿瘤活性。但无论是RET基因重排还是HER2突变，ctDNA相关研究有待深入开展。

目前，临床多通过影像学手段对肿瘤进行评估，但影像学进展多在分子生物学或细胞学改变之后，使其具有一定的滞后性；而临床常用的血清肿瘤标志物特异性有待提高。ctDNA作为一种极易获得的生物标志物，纵向评估肿瘤患者的进化和动态耐药情况，有助于预测药物疗效、耐药监测及探索耐药机制，展现了肿瘤的异质性、耐药机制多样性和复杂性。如能对发现早期耐药患者更早地采取措施，如联合靶向用药，有可能阻止或延缓耐药的进程，获得更持久的靶向疗效。越来越多的临床试验将ctDNA加入研究范围，随着对ctDNA认识的不断加深，ctDNA应用范围将越来越广，有希望参与肿瘤管理全程。但需要指出的是，血液ctDNA中良性体细胞异质性是一个重要混杂因素。在没有肿瘤的患者血浆游离DNA中，有可能识别到相似的TP53改变。因此，在ctDNA中检测癌症驱动基因的突变不能等同于肿瘤的证据。如临床情况允许，基于组织的基因检测仍是必要的。ctDNA可作为组织活检的补充，提高基因分型准确率，使靶向治疗更加精准。此外，对ctDNA的检测和分析制定统一标准，对检测技术进行优化，提高灵敏度，仍是ctDNA相关工作中亟待解决的问题。