柱前衍生FMOC-HPLC 法测定纺织品中胶原蛋白的含量

2020-12-29韩莹莹谭玉静赵海浪

纺织检测与标准 2020年6期

韩莹莹,谭玉静,赵海浪

（上海市质量监督检验技术研究院，上海200040）

0 引言

纺织品是人类生活和生产的必需品，由胶原蛋白纤维制成的纺织面料及服装，更能体现现代人高品质的健康生活。与一般植物蛋白相比，胶原蛋白更适合通过纺丝生产出蛋白纤维[1]，且其特有的螺旋结构能很好地锁住水分，给皮肤带来滋润和护理的效果。因此，胶原蛋白纤维与人体皮肤接触时有良好的亲和性，也具有较好的穿着舒适性。可以预见，未来胶原蛋白在纺织品上的应用更是今后纺织类用品发展的必然趋势。然而，由于对胶原蛋白的检测缺乏相应的方法和标准，导致市场上假冒伪劣产品横行，严重损害消费者的利益。因此，建立纺织品中胶原蛋白含量的检测方法，对当前相关监管机构、检测机构和生产企业是一项非常迫切的任务，且对今后功能性纺织品质量的有效监管也具有十分重大的意义。

鉴于羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性氨基酸，且含量稳定，因此，本试验以羟脯氨酸为研究对象，采用柱前衍生高效液相色谱法测定纺织品中胶原蛋白含量，希望研究结果可为功能性纺织品的质量控制提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：高效液相色谱仪，Agilent 1260 型，配有荧光检测器（FLD），安捷伦科技有限公司；超声发生器，SK-8210 HP 型，上海科导仪器有限公司；分析天平，TLE204 型，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；电热鼓风干燥箱，DGX-9423B-1，上海福玛仪器有限公司。本试验选用的安捷伦色谱柱为Agilent Poroshell HPH-C18，4.6mm×100mm，2.7μm。

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，购于CNW Technol⁃ogies GmbH（德国CNW）；盐酸、硫酸、磷酸氢二钠、硼酸钠为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试验用水，为成都优普UPH-I-5T 型超纯水系统现制备的高纯去离子水；羟脯氨酸标准品、邻苯二甲醛（OPA）试剂、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）试剂、硼酸盐缓冲液，安捷伦科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量羟脯氨酸标准品，用0.1 mol∕L HCl 溶液超声溶解，定容于容量瓶，稀释配制成9、27、45、90、180 pmol∕L 的系列标准溶液（1 pmol∕L=10-12mol∕L）。

1.3 衍生化试剂的制备

FMOC试剂：将1 mL安瓿瓶装的FMOC分装成10 份，每份各100 μL，装入样品瓶的锥形内插管中，盖封，4 ℃冷藏。此保存条件下，分装后的溶液在7～10 d内可保持稳定。

OPA 试剂：将1 mL安瓿瓶装的OPA分装成10份，每份各100 μL，装入样品瓶的锥形内插管中，盖封，4 ℃冷藏。此保存条件下，分装后的溶液在7～10 d内可保持稳定。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Poroshell HPH-C18，4.6 mm×100 mm，2.7 μm。

流速：1.5 mL∕min。

柱温：40 ℃。

流动相：A含10 mmol∕L磷酸氢二钠、10 mmol∕L硼酸钠的缓冲溶液，用盐酸调溶液pH值至8.2；B为甲醇、乙腈、水按45∶45∶10的比例的混合溶液。

梯度洗脱程序：0～0.35 min，B，2%；0.35～13.40 min，B，57%；13.40～15.70 min，B，100%；15.70～18.00 min，B，2%。

检测波长：激发波长266 nm，发射波长305 nm。按上述色谱条件可得到标准溶液及样品的色谱峰，详见图1和图2。

1.5 样品处理

将样品剪成5 mm×5 mm 的碎片，混匀，称取1.0 g 样品（精确至0.000 1g）置于三角烧瓶中，并准确加入10 mL 3 mol∕L 的硫酸溶液，盖上表面皿，置于110 ℃烘箱中恒温水解16 h，然后用滤纸过滤至50 mL容量瓶中，再加入9.5 mL 6 mol∕L 的NaOH 溶液（中和大部分过量的硫酸），定容，取适量溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液待测。

1.6 柱前衍生方法

衍生在自动进样器上在线自动完成，自动进样器程序按以下方式先后进行：

（1）吸取2.5 μL硼酸盐缓冲液；

（2）吸取1.0 μL样品；

（3）于清洗口混合3.5 μL，5次；

（4）等待0.2 min；

（5）于清洗口洗针，3 s；

（6）吸取0.5 μL OPA；

（7）于清洗口混合4 μL，10 次；

（8）于清洗口洗针，3 s；

（9）吸取0.4 μL FMOC；

（10）于清洗口混合4.4 μL，10 次；

（11）于清洗口洗针，3 s；

（12）吸取32 μL水；

（13）于清洗口混合20 μL，8 次；

（14）进样。

2 结果与讨论

2.1 水解液的选择

胶原蛋白在酸性条件下可以进行水解，因而试验时可以选择用硫酸或盐酸进行水解。用硫酸溶液可以直接在烘箱中完成水解，且水解时间比用盐酸溶液水解的时间短，并且整个试验操作过程也更方便，因而试验采用硫酸溶液水解羟脯氨酸样品。

2.2 衍生试剂的选择

经酸水解后的胶原蛋白可生成多种氨基酸混合物，其中羟脯氨酸、脯氨酸等少数氨基酸属于二级氨基酸，其他属于一级氨基酸。在采用高效液相色谱法分析氨基酸时，常用的柱前衍生试剂有丹磺酰氯（DANSYL-Cl）、异硫氰酸苯酯（PITC）、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）和邻苯二甲醛（OPA）等，且上述衍生试剂各有自身的优缺点[2-7]。其中，OPA因为衍生步骤简单，反应速度快，衍生物不受剩余试剂干扰，并且可用紫外、荧光或电化学检测器检测等优点而被广泛应用，但OPA 只能与一级氨基酸反应，不能与羟脯氨酸等二级氨基酸反应；而FMOC既能与一级氨基酸反应，也能与二级氨基酸反应。因而选择将OPA与FMOC联用，不仅可以克服两者单独使用时的缺陷，还有利于对羟脯氨酸的快速、准确测定。

2.3 方法的线性范围

在选定的色谱条件下测定所配制的一系列标准溶液。以羟脯氨酸的质量浓度为横坐标，被测物羟脯氨酸的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果表明，在9～180 pmol∕L 范围内，羟脯氨酸的峰面积和质量浓度呈现良好的线性相关性，回归方程y=9.871 27x+4.331 24，相关系数R2为0.998 6，方法检出限2.5 mg∕kg。