吴逸璇　熊启

摘 要 从种子寿命的概念出发，对其内外影响因素、生理机制进行综述。基于温度对种子贮藏和寿命的影响，对种子超低温贮藏技术的理论基础、主要方法和贮藏要点进行探究，突出强调了顽拗性种子的超低温贮藏困境与破解方法。

关键词 种子寿命;超低温贮藏;顽拗性种子

中图分类号：S339.3 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.30.105

对于单个种子，种子寿命是指种子从完全成熟到丧失生活力所经历的时间。实践中，每粒种子的寿命周期各不相同。因此，种子批的寿命指的是种子群体的发芽率从种子收获后到降到50%所经历的时间，称为种子的“半活期”。不同植物种子的寿命相差甚大[1]。

1 影响种子寿命的因素

1.1 内在因素

种子的物理性状如种子本身的种皮结构、硬度、种子大小、胚大小等都与种子寿命密切相关。

种子的化学性质也决定了种子寿命的长短，主要包含种子的化学组成和生理状态。在三大能源贮藏物质中，脂肪含量对种子寿命的影响高于糖类和蛋白质类物质。原因在于脂肪更为容易酸败，产生大量有毒物质，从而导致种子寿命缩短。因此，含油量较高的种子，如花生种子，往往比其他糖类、蛋白质类种子寿命更短，更难以贮藏。含水量的高低会影响种子的生理状态、呼吸强度，继而影响种子寿命。经典的种子生理学理论认为，种子贮藏水分的下限为5%～7%的含水量[2]，若低于此值，会发生种子结构或功能的破坏，从而导致种子活力下降。不过随着研究的进展，人们发现5%～7%含水下限的传统观点并非完全适用，种子超干贮藏理论逐渐发展起来。这种理论旨在应用其他方法突破技术可达到的种子含水量下限，同时提高种子的耐藏性[3]。

1.2 环境因素

种子的生命活动是在一定的温度、湿度、氧气和光照条件下进行的，这些环境因子的变化都会直接或間接影响种子寿命。随着环境温度的升高，种子的代谢活动加快，种子的贮藏寿命随之缩短。经过干燥处理后的种子，可以在零下低温条件下长期贮藏，且不会造成种子结构的破坏和进而导致的生活力降低，因此，目前超低温贮藏这一方向已成为种子贮藏的热门研究领域。

同时，在长时间的日光照射下，种子温度会相应提高，促进脂肪的氧化，从而导致种子失去活力，寿命缩短。室内散光虽然长时间作用于种子，但不会起显著影响[4]。

2 决定种子寿命的生理机制

2.1 有毒物质积累

在种子劣变过程中，各种生理活动产生的有毒物质逐渐积累，如无氧呼吸产生的酒精和CO2，蛋白质分解产生的胺类物质，脂质氧化作用产生的自由基[5]等，这些物质都会对种子产生毒害作用，致使其生理活性降低，乃至死亡。另外，其他的代谢产物如多种醛类、酚类、酸类物质都会对种子的正常生理功能产生损害。同样，过量的植物生长调节剂，如吲哚乙酸（IAA）等也会抑制种子的正常生理过程。

2.2 脂质过氧化

脂质过氧化和自由基增生是种子劣变的重要原因。脂质过氧化不但会损害膜结构，近些年来，关于脂质过氧化对DNA的损害理论也逐渐发展起来。一般认为，DNA的鸟嘌呤（G）最容易受脂质过氧化的危害，由于G碱基被占据的最高分子轨道是最高的，因而最容易被氧化。当种子老化到一定程度，核酸的修复能力下降，当核酸损伤到某一临界值后，种子将变成无活力种子。同时，脂氧合酶（LOX）是直接反应生成脂肪酸氢过氧化物的关键酶，从而导致脂质过氧化。LOX活性增加，种子劣变加速，活力下降，寿命变短。

3 种子超低温贮藏技术概述

3.1 理论基础

种子超低温贮藏是指利用液态氮（-196 ℃）为冷源，将种子等生物材料置于超低温（<-80 ℃）下，使其新陈代谢活动处于基本停止状态而达到的长期贮藏种子的方法。在如此低温下，由于种子代谢过程的停止，减少了与代谢有关的劣变，从而极大地延长了种子寿命。

种子内部的一切生理过程都以水为机制，如果可以将液态水转化为固态水或气态水，可以有效地控制种子内部的生理活性。在液态水缺失的状态下，种子处于“假死”状态，同时水的状态之间的转化是可逆的，故当恢复到正常液体状态后，植物种子又可以表现出正常的生理活性。因此，从理论上讲，种子在超低温保存过程中不会发生遗传性状和形态发生潜能的改变[6]。

然而，在降温过程中，如果种子内部的水分发生结冰现象，会造成细胞结构的损伤，乃至死亡。因此，植物种子超低温贮藏成功的关键，在于避免细胞内结冰。在降温过程中，如果溶液内没有形成均一晶核或晶核没有充足的时间继续生长，便会形成过冷溶液;如果继续降温，会形成均一晶核：如果降温速度较为缓慢，会形成尖锐的冰晶，如果降温速度足够快，细胞会来不及形成冰晶而直接被“固化”成玻璃态。在玻璃化形成过程中，则不会因产生大型冰晶而对细胞产生机械损伤。因此，在实际操作的冰冻过程中，先将种子经过渗透性化合物处理后，快速投入液氮，便会保持无定形态，避免结冰现象对细胞造成的损害[7]。

同时，在快速解冻过程中，同样可以使用高浓度大分子的冰冻保护剂并增大压力，来增强“玻璃化”现象，从而保证种子复苏后的活力。

3.2 超低温贮藏的主要方法

超低温保存的方法多种多样，包括玻璃化法、两步法、预冻法、包埋脱水法等。在实际运用中，以玻璃化法和两步法最为常用。

3.2.1 玻璃化法

样品在加入冰冻保护剂和脱水处理之后快速投入液氮中，运用了玻璃化原理，避免了大型冰晶的形成，保护细胞的形态与活力。该方法具有操作简易性、高度重演性、普适性等特点，因而得到广泛利用。

3.2.2 两步法

样品在加入冰冻保护剂和脱水处理后，用程序降温仪，以速率0.1～10.0 ℃·min-1降温至-40～-70 ℃，然后投入液氮中。

3.3 超低温贮藏技术的关键影响因素

3.3.1 种子含水量

针对超低温冷冻贮藏，种子含水量是关键的限制因素。种子含水量过高，则会在冷冻和解冻过程中加剧细胞的死亡，含水量过低又会导致种子生活力的部分丧失。不同的植物品种种子有其不同的含水量临界值，即适合于冷冻保存的最高含水量（High moisture freezing limits，HMFL）。若种子含水量超过HMFL，冷冻到一定温度，种子会死亡[8]。

3.3.2 冷冻保护剂

植物种子在超低温冷冻过程中，需要为其营造一个适宜的条件，以避免其受到冰冻伤害。研究表明，冰冻保护剂具有较好的保护效果，关于冷冻保护剂的使用量，应该取适宜的量，不宜过多，也不宜过低。过多会使细胞中毒并因渗透压变化而导致一系列破坏，过少又不足以起到冷冻保护效果。研究还发现，保护剂混合使用比单獨使用效果更好，目前比较主流的观点认为其之间存在协同效应[9]。

4 顽拗性种子的超低温贮藏

影响顽拗性种子超低温贮藏的因素有很多，包括取材部位、发育阶段、含水量、冷冻保护剂的使用、降温速度和解冻速度等。

1）在近些年的研究中发现，当使用离体胚或胚轴为材料时，顽拗性种子的超低温保存效果较好，因为离体胚或胚轴体积较小，可以在短时间内脱水，而胚自身相比整个顽拗性种子有较强的抗逆能力。2）随着研究的逐渐深入，利用超低温贮藏可以实现某些种子的成功保存。在Hirano关于白芨不成熟种子的玻璃化贮藏研究中，成功运用3种不同低温保存方案实现了白芨种子的超低温贮藏[10]。3）顽拗性种子也存在一个最高的冻结含水量，不同点在于顽拗性种子具有较高限度的最低安全含水量。而当种子的最低安全含水量低于最高冻结含水量时，超低温贮藏便具有较高的可行性。4）冷冻保护剂的使用可以有效地减少超低温贮藏对顽拗性种子活力造成的损害。5）对于顽拗性种子来说，较快的降温速度是较为理想的，因为这样可以因细胞内物质的玻璃化而减少大型冰晶的形成，减少伤害。

参考文献：

[1] 张红生，胡晋.种子学[M].北京：科学出版社，2015.

[2] 汪晓峰，景新明，郑光华.含水量对种子贮藏寿命的影响[J].植物学报，2001，43（6）：551-557.

[3] 廖宁汉，朱海林.含水量对种子贮藏寿命的影响[J].农家科技，2012（4）：50.

[4] 佟国君.影响种子寿命的几种因素[J].农村科学实验，2002（4）：5.

[5] 董新红，宋明.种子寿命研究进展[J].生物学杂志，2001，18（6）：7-9.

[6] 曾琳，顾雅坤，吴怡，等.超低温对降香种子遗传变异和生理特性的影响[J].热带作物学报，2018，39（9）：1732-1738.

[7] 宋红，曹柏，王玲.超低温保存对玉蝉花种子生理生化特性的影响[J].东北林业大学学报，2016，44（4）：44-47.

[8] 曾琳，何明军，顾雅坤，等.五种豆科药用植物种子超低温保存技术研究[J].生物资源，2017，39（1）：42-47.

[9] 程利红，段旭昌，张宗勤，等.中国红豆杉种子超低温保存技术研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（2）：71-78.

[10] Hirano T， Godo T， Mii M， et al. Cryopreservation of immature seeds of Bletilla striata by vitrification[J].Plant Cell Reports，2005，23（8）：534.

（责任编辑：赵中正）