曹玉环，苑学礼

(哈尔滨医科大学附属第四医院肿瘤内科，哈尔滨 150001)

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T细胞)免疫疗法来源于过继性T细胞疗法，现有3种形式的过继性T细胞疗法用于癌症治疗，包括肿瘤浸润淋巴细胞疗法、T细胞受体工程化T细胞疗法、CAR-T细胞疗法[1]。随着细胞工程技术的快速进展，CAR-T细胞免疫疗法在临床中除顽固肿瘤外均取得了持久的临床疗效，表现出巨大的潜力。自应用T细胞工程构建成功CD19 CAR-T细胞后，其被美国食品药品管理局批准用于治疗顽固性前-B细胞急性淋巴细胞白血病和扩散大B细胞淋巴瘤[2-3]。与血液肿瘤不同，实体肿瘤微环境中存在大量的纤维基质和免疫抑制细胞，同时通过物理屏障和免疫屏障保护肿瘤组织、抵抗免疫细胞的攻击。目前，科学家们正在尝试各种办法克服这些问题，如研发靶向成纤维细胞活化蛋白的CAR-T细胞以减少肿瘤周围纤维结缔组织的形成来增加淋巴细胞浸润，制备靶向免疫检查点的CAR-T细胞等。除屏障外，实体肿瘤周围往往伴随血管畸形和纤维结缔组织增生，形成低氧、酸性、缺乏必需氨基酸(精氨酸、色氨酸等)的微环境。在这种环境下，浸润T细胞存活困难、激活障碍，较难达到理想的肿瘤杀伤效果。精氨酸和色氨酸是T 细胞激活所需要的重要物质，而肿瘤细胞和骨髓细胞在肿瘤微环境中能够分泌精氨酸酶和吲哚胺2，3-二氧化酶来分解精氨酸和色氨酸，阻碍T细胞的增殖和持续激活[4]。已有学者发现，神经母细胞瘤可通过过表达精氨酸酶Ⅱ抑制靶向双唾液酸神经节苷脂2(disialoganglioside 2，GD2)的CAR-T细胞在微环境内的增殖[5]。这为突破这一难题提供了新思路。有研究显示，抑制吲哚胺2，3-二氧化酶活性后，CAR-T细胞的增殖和杀伤能力均增强、分泌细胞因子增加[6]。现就CAR-T细胞在实体肿瘤治疗中的应用进展予以综述。

1 CAR的概述

CAR由Gross等[1]于1989年首次提出，它的基本结构包括识别胞外抗原的单链可变区片段(single-chain fragment variable，scFv)、源于CD8α或CD28等序列连接胞外抗原和胞内信号肽区的跨膜结构域及激活和传递T细胞活化信号功能的胞内共刺激信号结构域，其中共刺激信号结构域通常由CD28受体家族的CD28、可诱导共刺激分子或肿瘤坏死因子受体家族的4-1BB、OX40、CD27以及CD3ζ等相关序列组成。目前，研究者们根据胞内共刺激序列的种类、数量以及是否经过特定的基因修饰[如连接细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-17、IL-12、IL-18以分泌γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α等或连接表达抗程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)单抗的scFv]将CAR-T细胞分为四代[4，7](表1)。

表1 不同代次CAR-T细胞的结构特点

近年来，CAR-T细胞因高度的特异性以及强大的抗肿瘤免疫功能被广泛应用于各种恶性肿瘤的实验研究和临床治疗。其中研究最广泛、疗效较好的为CD19 CAR-T细胞[8]，且2017年美国食品药品管理局、2018年欧洲药品管理局先后批准了两个相关产品Kymriah和Yescarta上市用于血液系统恶性肿瘤的临床治疗。虽然CAR-T细胞在血液系统肿瘤领域取得较好的疗效，但其在实体肿瘤治疗方面的临床试验结果却不理想，仍面临着许多问题。

2 CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用

目前，用于CAR-T细胞治疗研究的靶点十分繁杂，包括经典肿瘤标志物，新近发现的肿瘤相关抗原，以及一些在正常组织细胞也能较高表达的靶点分子(如细胞分化簇抗原)等。因肿瘤特异性高低差异性较大，现依据靶点类型对CAR-T细胞进行分类(表2)。

2.1CD类靶点 虽然绝大部分的CD类靶点主要被应用于血液系统肿瘤及淋巴瘤的研究中，但近几年其在实体肿瘤中的研究也在不断开展。CD70是一种糖基化跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体家族中的一员[9]。研究发现，天然的CD70仅表达于极度活化的T、B淋巴细胞和一小部分成熟的树突状细胞，因受免疫抑制作用的影响很少在肿瘤细胞中表达，但在某些恶性血液病及实体肿瘤中存在异位表达现象[10-12]。2019年9月佛罗里达大学威尔斯神经外科与哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科联合研究[13]，发现有70%的同系胶质母细胞瘤小鼠模型可表达CD70，随后他们将IL-8(也称为CXC趋化因子配体8)受体(CXC趋化因子受体1和CXC趋化因子受体2)修饰的CD70 CAR-T应用于该小鼠模型的治疗，结果显示近40%的小鼠被治愈，表明CAR-T细胞具有较强的抗肿瘤效应。其原因为经IL-8诱导修饰后的CAR-T细胞能更多地向肿瘤部位迁移聚集，因此后期他们通过电离辐射的手段来刺激IL-8的分泌以达到更佳的抗肿瘤效应。除胶质母细胞瘤外，他们还在卵巢癌及胰腺癌中应用了CD70 CAR-T细胞并观察到类似结果，证明了CD70作为相关靶点治疗实体肿瘤的有效性。

除CD70外，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究者们构建了一种CD40配体(CD40 ligand，CD40L)CAR-T细胞并进行相关研究，结果发现CD40/CD40L介导的细胞毒性和持续诱导的内源性免疫反应可引起抗原丢失来规避肿瘤的免疫逃逸机制，从而达到更优的抗肿瘤效应[14]。除CD40L外，还有许多其他同类靶点被研究应用。

2.2经典肿瘤标志物类靶点 前列腺癌是最常见的男性生殖系统恶性肿瘤，其发病率随年龄的增长而增加，严重威胁着人类健康。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是一种前列腺相关抗原，具有较高的特异性和膜结合性，在前列腺癌尤其是非激素依赖型前列腺癌及其转移灶中高表达[15]。Ma等[16]利用此靶点制备了第一代和第二代PSMA CAR-T细胞，并通过试验发现第二代较第一代具有更强的肿瘤杀伤作用，且能分泌更多的细胞因子(IFN-γ和IL-2等)。Junghans等[17]为6例转移性或复发性及激素难治的前列腺癌患者中的5例注射了靶向PSMA的第一代CAR-T细胞，同时给予低剂量IL-2，结果显示5例患者均未发生明显的不良反应且其中2例还获得了部分反应。此外，他们还发现患者的应答情况与输注的CAR-T细胞量成反比，但与IL-2水平直接相关，推测可能与大量的CAR-T细胞会消耗较多的IL-2有关。

表2 靶点类型、相关靶点及应用肿瘤

为了避免在人类中应用含有传统鼠源性scFv的CAR所引起的潜在免疫抑制反应，研究者们首次使用骆驼科动物纳米抗体构建了新型的PSMA CAR-T细胞，结果证实该T细胞不仅可以特异性杀伤PSMA+细胞，还可刺激细胞因子IL-2的分泌及CD69、CD107a(自然杀伤细胞抑制性受体)表达上调[18]。同时，他们还发现该T细胞与PSMA+细胞共培养时增殖率较之前增加了约0.6倍，表明了新型CAR-T细胞的治疗优势。

此外，还有前列腺干细胞抗原在前列腺癌[19]、癌胚抗原在结直肠癌[20]、甲胎蛋白主要组织相容性复合体复合物在肝癌[21]等一系列的相关研究。

2.3生长因子、细胞因子、激素受体及其突变体和类受体类靶点

2.3.1表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)及EGFRⅢ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ) CAR-T细胞 EGFR是一种受体酪氨酸激酶，其异常表达可能与包括神经胶质瘤、肺癌在内的上皮来源性肿瘤相关[22]，研究显示其在非小细胞肺癌中的表达率超过了50%[23]。EGFRvⅢ 是最常见的EGFR突变体，它仅在肿瘤组织中表达而在正常组织中极少表达[24]。有研究者将传统的抗EGFR及EGFRvⅢ CAR-T细胞应用于相关肿瘤的小鼠模型中进行实验研究，结果发现这些CAR-T细胞对相应的肿瘤细胞均能起到一定的杀伤作用，证明了这些CAR-T细胞的有效性[25-26]。

在前期试验的基础上，Sampson等[27]通过基因工程改造构建了新的第三代EGFRvⅢ 信使RNA CAR-T细胞并在人神经胶质瘤U87细胞系小鼠模型中进行了实验，他们发现该信使RNA CAR-T细胞不仅能杀伤肿瘤细胞，还能预防肿瘤的复发。Choi等[28]构建了另一种新型双顺反子式EGFRvⅢ CAR，该CAR可以表达一种针对EGFR的双特异性T细胞衔接子，即在重定向CAR-T细胞的同时还可募集未转导的T细胞来对抗野生型EGFR，这样既可以消除EGFRvⅢ阳性胶质母细胞瘤又可以消除EGFRvⅢ阴性EGFR阳性的异源性肿瘤。同年，上海交通大学癌基因研究中心[29]也构建了一种新的806-28Z CAR-T细胞，他们同样验证了其对胶质母细胞瘤的杀伤作用；且经分析还发现，该T细胞剂量不同对EGFRvⅢ阳性肿瘤细胞的杀伤作用也不同，低剂量时仅抑制肿瘤细胞生长，而高剂量时才发挥杀伤作用甚至治愈荷瘤小鼠，同时被治愈的小鼠还可获得对抗该肿瘤细胞的记忆。

除胶质瘤外，一项研究还显示了靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞在体内及体外对表达EGFRvⅢ的肺癌细胞也具有显著的抗肿瘤效应[30]。

2.3.2人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor，HER)2 CAR-T细胞 HER2同属ErbB家族，可在多种肿瘤中过表达，且其异常激活与癌症预后密切相关[31]，是近年研究较为广泛的靶点之一。前期研究者们进行了大量的试验验证了抗HER2 CAR-T细胞对HER2阳性细胞的有效性，但还有研究显示因使用鼠源性scFv构建CAR导致宿主产生了强烈的免疫排斥反应而被限制临床使用[32]。针对此Sun等[33]尝试构建了含人源化scFv的chA21-28z HER2 CAR-T细胞，该T细胞在体内及体外对HER2+乳腺癌和卵巢癌细胞均具有较强的杀伤作用，且还减少了免疫排斥反应的发生。另有学者利用来源于结肠癌患者的异种移植物模拟建立了更接近于真实患者的小鼠模型，结果发现抗HER2 CAR-T细胞在消除异种移植物后进一步将相关的肿瘤细胞消除，同时还预防了本批次实验小鼠结肠癌的复发[34]。

此类靶点除了研究较为广泛的EGFR、EGFRvⅢ 及HER2外，还有促红细胞生成素产生肝细胞受体A2[35]、IL-13受体α2[36-37]、自然细胞毒性受体[38]、叶酸受体α亚型[39]、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1[40]等。

2.4肿瘤相关的糖蛋白、蛋白及糖脂类靶点

2.4.1间皮素CAR-T细胞 间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其在间皮瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌及肺癌等癌细胞表面表达水平较高[41-42]。2014年，宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心的研究人员首次利用信使RNA电穿孔技术获得了瞬时表达的T细胞制备了新的CAR-T细胞，然后分别以静脉和瘤内两种不同的注射方式将其应用于晚期恶性胸膜间皮瘤及转移性胰腺癌患者中，结果发现该T细胞在发挥抗肿瘤效应的同时还避免了CAR-T细胞治疗中最常见的靶外毒性反应的发生[43]。

有研究者利用间皮素scFv、CD3ζ、CD28和DAP10细胞内信号转导域(M28z10)构建了一种靶向间皮素的CAR-T细胞即M28z10 T细胞，得出该T细胞对多种胃癌细胞系均有强大的抗肿瘤功效，且对转移性胃癌也同样起作用[44]。同时，他们还发现肿瘤局部给药较全身静脉给药能更早地促使T细胞浸润到肿瘤组织中。这说明注射部位的不同也影响CAR-T细胞的作用，应尽可能减少CAR-T细胞在运输过程中的损耗以达到更强的抗肿瘤效应。

2.4.2磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，GPC3) CAR-T细胞 GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在细胞的生长、分化和迁移中起重要作用[45]，这种蛋白多糖在正常组织中几乎不表达，而在肺癌、肝癌、黑色素瘤等肿瘤中高表达，且表达越强预示着肿瘤生长和转移的可能性越大[46]。Li等[47]利用慢病毒制备了第三代抗GPC3 CAR-T细胞，并验证了其在体内外对GPC3+肺鳞状细胞癌均具有显著的抗肿瘤效应，同时他们还观察到在肿瘤细胞被裂解时可检测到IFN-γ、IL-2、肿瘤坏死因子-α、IL-4及IL-10等细胞因子分泌增加。随后，上海市肿瘤研究所的研究人员[48]在喉鳞状细胞癌的小鼠模型中再次验证了第三代抗GPC3 CAR-T细胞的抗肿瘤效应。

有研究者利用一种能够诱导表达IL-12的人或鼠源性GPC3特异性T细胞即GPC3-28Z-NFAT-IL-12-T细胞来对抗GPC3+肿瘤细胞，结果显示该T细胞不仅可以裂解肿瘤细胞还可以促进细胞因子的分泌；且与体外试验相比，其在体内具有更强的抗肿瘤效应[49]，这可能由于修饰后的T细胞可分泌IL-12，从而促进IFN-γ的产生使得T细胞能够持久地浸润于肿瘤组织发挥作用。同时他们还发现，分泌的IL-12减少了已建肿瘤模型中调节性T细胞的浸润；且在具有免疫能力的宿主中，低剂量的GPC3-28Z-NFAT-IL-12-T细胞无须事先调节就可以发挥抗肿瘤功效。

2.4.3GD2 CAR-T细胞 GD2是一种双唾液酸神经节苷脂，在几乎所有的神经母细胞瘤中高表达，并可能在肿瘤的免疫逃逸中发挥作用[50-51]。近几年开展的一些研究也验证了抗GD2 CAR-T细胞在高危神经母细胞瘤、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤等神经系统肿瘤方面的有效性[52-53]。Prapa等[54]将衍生自IgM类鼠源抗体的抗GD2 scFv通过人CD8α铰链跨膜结构域与共刺激分子4-1BB(CD137)、CD3-ζ信号结构域相连接构建了新的CAR-T细胞，该CAR-T细胞结合了抗GD2 scFv的特性和4-1BB分子驱动的有效共刺激性，在体内外对GD2阳性神经母细胞瘤显示出较强的杀伤作用。

Chen等[55]将抗GD2 CAR-T细胞进行了改造即为其优化添加了细胞因子IL-15，结果发现改造后的T细胞在与相关抗原结合前能更持续有效地存活下来而不被灭活，同时还能向肿瘤部位提供额外的细胞因子传导信号。同时，它还可以减少程序性细胞死亡受体1的表达、富集干细胞样细胞及对体内外反复暴露的肿瘤发挥出优于传统抗GD2 CAR-T细胞的抗肿瘤效应等。这项研究再次表明了细胞因子在CAR-T细胞治疗中的重要性，今后可以考虑通过筛选将有效的细胞因子以最佳的方式添加至CAR-T细胞以促使它们发挥协同作用来制备出更强的抗肿瘤“武器”，但与此同时应密切监测细胞因子水平的变化，以防止细胞因子释放综合征的发生。

此外，同类相关靶点黏蛋白1[56]、黏蛋白16[57]、硫酸软骨素蛋白多糖4[58]、碳酸酐酶Ⅸ[59]、糖蛋白100[60]、肝素酶[61]等也被应用于相关的实体肿瘤。

2.5细胞黏附分子及细胞间连接相关分子类靶点 细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一种跨膜分子，是免疫球蛋白超家族中的一员，它参与了细胞间内皮迁移、信号转导、极性和稳定性的维持等重要过程。同时其可溶性部分在炎症、慢性疾病和许多恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的进展、转移及预后相关[62]。Min等[63]针对该靶点进行了相关研究，首先他们构建了第三代ICAM-1特异性CAR-T细胞，然后将其应用于间变性甲状腺癌异种移植小鼠模型中，结果观察到此T细胞具有强大而持久的肿瘤根除作用。同一时期，Park等[64]研究发现T细胞在体外的抗肿瘤效力与CAR的亲和力及ICAM-1的密度呈正相关，即微摩尔亲和力的CAR-T细胞较纳摩尔的同类物能发挥更优的抗肿瘤功效。

除此之外，还有L1细胞黏附分子特异性CAR-T细胞被用于儿童复发性或难治性成神经细胞瘤的治疗中[65]；上皮细胞黏附分子特异性CAR-T细胞被应用于乳腺癌(NCT02915445)、肝癌、胰腺癌、结直肠癌及前列腺癌(NCT03013712)的临床试验招募研究中等。

2.6其他肿瘤特异性或相关性抗原类靶点 除上述几大类靶点外，其他与肿瘤密切相关的靶点研究也在不断开展中，如纽约食管鳞状细胞癌1靶点在肺癌、卵巢癌和骨肿瘤中的临床试验也在招募中(NCT03029273)。

目前，CAR-T细胞治疗实体肿瘤的相关靶点选择呈现多元化，这也是由实体肿瘤本身具有的丰富异质性所决定的。随着抗原合成、筛选、构象分析等技术的发展和肿瘤靶抗原的不断更新，未来实体肿瘤靶点的选择性将更多元化。

3 CAR-T细胞治疗在实体肿瘤应用中面临的问题及可能的解决策略

3.1靶点的选择 CAR-T细胞应用于恶性肿瘤治疗的前提是靶抗原的选择。理想的靶抗原应只在肿瘤细胞表面特异性表达而在正常组织中不表达或表达水平极低，但由于实体肿瘤表面存在异质抗原，很难找到符合这一标准的靶抗原，由此引起了靶外或靶向毒性，如EGFR和HER2靶点除了在肿瘤组织中表达外还在正常的心肺组织表达，这就导致了靶向该靶点的CAR-T细胞对心肺组织的“误伤”[2]。

为了克服这一难题，研究者们尝试了多种方案，如通过RNA转染技术或基因工程将自杀基因导入以获得瞬时表达的CAR-T细胞以减轻其对正常组织的损害[66-67]，或在CAR的抗原识别结合区和胞内信号区之间连接一个“开关”装置，使其在需要时触发“开关”开始“工作”，而不需要时处于“关闭”无效状态[68]。此外，还可以为CAR串联双特异性靶抗原，只有当其与所有抗原同时结合时才能被充分活化发挥杀伤作用[48，69]。

3.2CAR-T细胞在体内的增殖存活 研究发现，在慢性淋巴细胞白血病的患者中CD19 CAR-T细胞在体内的扩增和存活时间与患者对该细胞的应答呈正相关，增殖速度越快、持续存在时间越久，该细胞在患者体内的有效应答越持久[70]。然而，与血液系统肿瘤相比，CAR-T细胞在实体肿瘤中的增殖存活情况并不乐观[39，65]。目前影响CAR-T细胞在实体瘤患者体内存活的因素尚不明确，考虑可能与CAR-T细胞的分化和功能状态、CAR与靶点的亲和力、CAR的免疫原性及患者的自身因素相关[71]。

Guedan等[72]通过研究证明，可诱导共刺激分子细胞内信号转导域可以大大增强CD4+CAR -T细胞在体内的持久性，进而提高表达CD28或4-1BB的CD8+CAR-T细胞的持久性，随后他们验证了结合可诱导共刺激分子和4-1BB胞内结构域的第三代CAR-T细胞除了表现出优异的抗肿瘤作用外，在体内的持久性也提高。这表明，通过改造CAR的内部结构可改善CAR-T细胞在体内的持久性，但具体改造措施仍需不断研究。

3.3CAR-T细胞在体内的运输 如何将CAR-T细胞有效地运输至肿瘤部位是CAR-T细胞在实体肿瘤中应用的又一难题。这一难题是由于存在于实体瘤周围的肿瘤浸润淋巴细胞数量较少，需通过规避肿瘤T细胞的免疫排斥机制来促使CAR-T细胞浸润到肿瘤组织中[71]。针对此问题研究者们探索了一系列可行策略，如在CAR-T细胞中添加肿瘤细胞特异性趋化因子来增加其向肿瘤部位的募集[73-75]，或改善肿瘤周围的细胞、组织、血供等来增加CAR-T细胞在肿瘤部位的浸润[61，76-78]等。除上述策略外，未来仍需积极探索其他可行策略。

3.4肿瘤微环境 肿瘤微环境的免疫抑制作用很大程度地限制了CAR-T细胞在实体肿瘤中的临床应用。首先，肿瘤微环境中存在一些免疫抑制点分子(程序性细胞死亡受体1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，它们会抑制T细胞的活性[79]；其次，肿瘤的恶化及其体积与重量的增加也会改变肿瘤周围的微环境，使其产生免疫耐受的现象，即使CAR-T细胞被成功地运输到肿瘤部位也会被抑制灭活[80]；同时，实体肿瘤中还存在阻碍CAR-T细胞向肿瘤部位有效渗透和浸润的周围基质及异常脉管系统[2]；另外，肿瘤引起的缺氧、低营养状态以及高浓度代谢酸也均使得T细胞无法增殖产生细胞因子[81]；最后肿瘤浸润液中还富含调节性T细胞、髓样抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤相关中性粒细胞等，它们分泌的转化生长因子-β、IL-10、硝酸和吲哚胺2，3-二氧化酶等均会促进肿瘤细胞的生长[82]。

为了改善因肿瘤微环境引起的免疫抑制作用，研究者使用连接抗PD-L1单抗的scFv序列构建了新的CAR-T细胞，该CAR-T细胞在杀灭肿瘤细胞的同时还分泌了抗PD-L1单抗使之与肿瘤细胞表面的PD-L1分子结合以解除免疫抑制状态[7]；另有研究者利用基因编辑技术将CAR-T细胞表面表达程序性细胞死亡受体1的基因去除以解除免疫抑制作用[83]等。

4 小 结

CAR-T细胞在血液系统肿瘤领域取得了较大进展，这也激发了许多研究者对CAR-T技术在实体肿瘤中运用研究的兴趣，多项CAR-T细胞治疗实体肿瘤的基础和早期临床试验正在开展。但CAR-T细胞研究中的T细胞设计、基因编码和细胞生产均是T细胞疗法潜在的负担，由于缺乏非临床试验资料，导致不能有效评估项目的安全性和有效性，不能预见早期临床试验中可能遇到的安全性问题，导致其在实体肿瘤中的应用仍较困难。相信在不久的将来将出现更加成熟、安全和有效的CAR-T细胞治疗技术。