朱志达，朱安龙

(哈尔滨医科大学附属第一医院结肠直肠外科，哈尔滨 150001)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常见的癌症之一，现居癌症死亡原因的第三位[1]。近年来虽然外科技术有所提升，化疗药物和分子靶向药物的研究也有所突破和进展，但CRC患者的数量仍逐年增加。研究显示，约20%的CRC患者在确诊时已出现转移，是导致患者死亡的主要原因之一[2]。一旦肿瘤扩散到远处器官，无论是传统化疗还是靶向治疗均无法治愈。因此，了解CRC转移机制、寻找与远处转移相关靶点非常重要。

目前，有关癌细胞在机体环境中生存并形成转移的确切机制仍不清楚。据报道，几种类型的宿主细胞，如成纤维细胞、巨噬细胞[肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)]、间充质干细胞等在肿瘤微环境中发挥重要作用[3]。此外，一些被称为肿瘤相关中性粒细胞(tumor-associated neutrophils,TANs)的细胞群体可以支持癌细胞的生长、侵袭及血管生成。中性粒细胞是机体防御外来致病源的第一道防线，是机体免疫系统的重要组分之一。但有研究表明，中性粒细胞在肿瘤转移中发挥支持作用[4]。不同的细胞因子作用于微环境可使TANs产生不同的分化表型，进而产生不同的作用。现就TANs在CRC中的作用予以综述。

1 TANs概述

1.1TANs分型 肿瘤微环境在促进肿瘤转移中发挥重要作用,对后续的治疗及总体生存率有显著影响。作为肿瘤微环境中的一个关键因子，TANs在癌症发生发展中起重要的调节作用[5]。研究表明，肿瘤微环境的各种刺激激活了TANs的不同表型，其既能够分化成抗肿瘤的N1表型，也能够分化成促肿瘤的N2表型[6]。尽管功能上存在差异，但尚未有明确的表面标志物能区分N1和N2表型的TANs，不同表型的表面标志物、转录调节因子以及细胞因子谱仍有待研究。N1表型的TANs通过产生肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子1、活性氧类、死亡受体，并减少精氨酸酶的表达，增加细胞毒性，降低免疫抑制能力，发挥抗肿瘤作用[7]。而N2表型的中性粒细胞通过表达精氨酸酶、基质金属蛋白酶9、血管内皮生长因子及多种趋化因子支持肿瘤扩展[8]。TANs分化表型的差异与肿瘤微环境中的信号分子有很大关系。Fridlender等[9]报道，转化生长因子-β信号通路在N1与N2表型间起调节作用：肿瘤内的转化生长因子-β使分化倾向于N2表型，而抑制转化生长因子-β则诱导N1表型表达。有文献报道，在肺癌中小剂量β干扰素可诱导N1表型分化，提高肺内中性粒细胞的抗肿瘤活性[10]；在小鼠肿瘤模型中，β干扰素治疗后中性粒细胞抗肿瘤特性增强，迁移能力降低，提示β干扰素治疗有效[11]。

1.2TANs的募集 肿瘤微环境中的肿瘤细胞与中性粒细胞的相互作用常通过趋化因子受体与配体的相互作用完成。多种免疫细胞(包括中性粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞)浸润肿瘤，并参与肿瘤微环境与其他非免疫基质细胞的调节[12]。来源于骨髓的细胞(包括TAMs、TANs和髓源性抑制细胞)有助于肿瘤进展[13]。免疫组织化学分析表明，中性粒细胞与各种癌组织混杂在一起受趋化因子的调节[14]。趋化因子由肿瘤细胞生成，是一种与G蛋白偶联受体结合的小肽，可诱导趋化、炎症和(或)血管生成，是促进肿瘤转移的关键因素之一[15]。肿瘤细胞常产生多种炎症趋化因子，包括吸引中性粒细胞的趋化因子，促进TANs募集。中性粒细胞向肿瘤的迁移主要由趋化因子配体与趋化因子受体1/2结合介导。趋化因子及其配体负责正常生理条件下中性粒细胞的募集，并参与TANs的活化，促进TANs的聚集[16]。在肿瘤荷瘤小鼠中，靶向趋化因子受体2介导的TANs活化增加了肿瘤浸润淋巴细胞的数量，并增强抗程序性死亡检查点1的阻断[17]。肿瘤细胞分泌的趋化因子在TANs的募集中发挥重要作用，在胰腺癌小鼠中，CXC趋化因子受体2阳性TANs和CC趋化因子受体2阳性TAMs的双重阻断破坏了骨髓细胞的募集，提高了抗肿瘤免疫能力[18]。因而，阻断趋化因子受体可能有助于提高机体的抗肿瘤能力。

1.3促进CRC转移瘤血管的形成 转移是肿瘤难以根治的重要原因，与肿瘤血管的形成密不可分，TANs和TAMs均具有促进肿瘤血管生成的潜力。在各种小鼠模型中，TAMs和TANs是基质金属蛋白酶9的主要来源，通过降解细胞外基质促进血管生成[19]。而基质金属蛋白酶9的表达仅在中性粒细胞中发现，故中性粒细胞耗竭可抑制原发肿瘤的血管生成。在肿瘤异种移植模型中，粒细胞集落刺激因子促进中性粒细胞在肿瘤的募集，使中性粒细胞的前动力蛋白-2表达上调，进而促进肿瘤血管生成，从而导致抗血管内皮生长因子治疗的抗药性[20]。在人体CRC肝转移以及实验性小鼠肠道肿瘤肝转移模型中均发现，成纤维细胞生长因子2在中性粒细胞中表达，中和抗成纤维细胞生长因子2的抗体可导致中性粒细胞耗竭，进而减缓肝转移灶的生长，降低血管密度，故在一定程度上耗竭TANs可减少肿瘤微血管的形成，减缓肝转移瘤的生长[21]。因此，寻找肿瘤微环境中抑制血管生成的相关因子，对抑制肿瘤转移、提高患者预后具有重要意义。

2 TANs在CRC中的价值

2.1TANs与CRC的预后 炎症细胞浸润在CRC患者的免疫反应中起重要作用，其促进了CRC的发生发展。中性粒细胞作为重要的炎症细胞之一，在肿瘤微环境中通过形成网状物、释放活性氧类、分泌促肿瘤细胞因子、趋化因子以及免疫抑制等促进肿瘤发生。中性粒细胞是影响肿瘤患者生存的细胞群，对患者的预后有重要意义[22]。中性粒细胞聚集在癌症患者特别是在晚期患者的外周血中，高循环中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio,NLR)是肿瘤患者临床预后较差的生物标志物，NLR增高提示接受根治性手术治疗的CRC患者生存率降低[23]。Dell′Aquila等[24]报道，NLR可作为不可切除的转移性CRC患者应用贝伐单抗联合化疗预后不良的预测因子。因此，可通过测量NLR预测CRC患者的预后。NLR越高，患者接受化疗药物时的抵抗力越高，CRC患者的生存率越低[25]。

目前，关于TANs对CRC患者生存的影响存在争议。Rao等[26]认为，肿瘤内中性粒细胞的增加与恶性表型相关，可预测CRC的不良预后。但Berry等[27]分析了CRC组织中中性粒细胞的数量认为，高水平的TANs与Ⅱ期CRC患者的总体生存改善有关。这可能与肿瘤微环境的信号影响中性粒细胞表型分化有关。文献报道，肿瘤抑制基因Smad4的缺失通过趋化因子受体与配体轴将CC趋化因子受体1阳性髓细胞聚集到侵袭前部而促进原发性CRC进展，且CC趋化因子配体15在原发性和转移性CRC中的表达是CRC患者预后的预测因子[28]。以上结果可能为趋化因子抑制剂在原发性CRC手术切除后作为辅助治疗及预防CRC转移提供依据。

2.2TANs与CRC肝转移 CRC患者的死亡主要与肝、肺等重要器官转移有关。肝转移是一个复杂多步骤的过程，在肿瘤原发灶，转化的肿瘤细胞通过分泌血管生成因子而产生广泛的血管化，肿瘤细胞局部浸润血管或淋巴管。大部分循环肿瘤细胞被血液流动的剪切力或宿主免疫系统破坏，仅少部分滞留于器官的毛细血管床中，肿瘤细胞外渗到器官实质并形成微转移[29]。这种侵袭和种植转移是肝转移的关键步骤。通过脾注射接种肿瘤细胞的小鼠肝转移模型证明了在肝内定植过程中TANs与CRC细胞间存在相互作用[30]。表达CRC细胞的小鼠招募表达CC趋化因子受体1阳性的髓样细胞，在肝脏中形成早期转移灶，TANs产生的基质金属蛋白酶9有助于癌灶在早期的扩大，同时招募表达CC趋化因子受体1阳性的髓样细胞也有助于原发性CRC的浸润和肝、肺转移，而几乎所有的在转移灶聚集的表达趋化因子配体的细胞均为TANs。敲除髓系细胞中CC趋化因子受体1可显著抑制原发性和转移的肿瘤生长[31]，表明CC趋化因子受体1抑制剂可能是治疗CRC及其转移的一种有前途的策略。

CRC转移灶的形成与转移部位血管的形成密不可分。CRC细胞分泌的趋化因子8与TANs表达的相关配体结合后在CRC的转移中起重要作用。趋化因子8作为血管内皮生长因子的代偿途径维持肿瘤血管生成[32]。趋化因子配体8在肿瘤浸润前表达上调，促进了CRC肝转移，而短发夹RNA介导敲除趋化因子配体8基因可导致血管内皮生长因子A表达减少，显著减少细胞的增殖、迁移和侵袭，同时也减少了肿瘤的体内转移，提示趋化因子配体8的过表达可诱导血管内皮生长因子依赖的血管生成反应[33]。趋化因子配体8的表达可增加葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎中未成熟髓细胞的动员，加速急性炎症和结肠癌的发生[34]。以上研究均提示，趋化因子配体8在CRC的浸润和转移中起促进作用。在趋化因子受体2相关基因敲除小鼠中，趋化因子受体-配体轴在宿主细胞中的缺失可抑制CRC生长和转移[35]。此外，趋化因子受体1/2拮抗剂可通过减少肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡抑制CRC的肝转移[36]。联合应用趋化因子受体2拮抗剂和奥沙利铂可显著减少肿瘤生长和血管生成[37]。总之，趋化因子配体的表达在促进肿瘤进展中发挥了积极作用，而相关配体的阻断可能为CRC的治疗提供新方向。

中性粒细胞胞外诱捕器可能与肿瘤相关血栓形成和肿瘤进展有关。中性粒细胞胞外诱捕器的核心结构是颗粒酶装饰的去核染色质纤维，充当诱捕微生物的网，进而促进病原体与中性粒细胞衍生的效应分子之间的相互作用[38]。肿瘤生长本身诱导的缺氧状态和分泌的集落刺激因子可促进中性粒细胞形成网状物。对CRC小鼠肝转移模型进行研究发现，网状物通过加强建立转移灶或促进现有微转移灶生长，促进CRC生长，也有助于转移灶形成过程中的迁移、侵袭和增殖，而利用DNA酶抑制中性粒细胞胞外诱捕器是一种具有潜在临床应用前景的方法[39]。

其他信号分子也参与了中性粒细胞的促肿瘤作用。在人CRC肝转移及小鼠肝转移模型中均有中性粒细胞浸润，在肝转移灶中，TANs表达了促血管生成分子，表明肿瘤微环境中的中性粒细胞发生极化[21]。中和促血管生成分子可引起中性粒细胞消耗，并减少肝转移微病灶的生长降低转移灶的血管密度[40]。此外，肝脏本身的信号转导途径也调节TANs表型的分化，促进肝转移。患有条件性肝特异性胰岛素样生长因子1缺乏症的转基因小鼠接种CRC细胞后3周，肝脏中浸润的中性粒细胞虽然数量增加，但并未表现出促瘤表型特征[41]。表明肝脏中胰岛素样生长因子1对促进中性粒细胞向促肿瘤表型分化有积极影响，持续的胰岛素样生长因子1缺乏可能是改变中性粒细胞表型的必要条件。与之类似，在肝脏中高表达的组织金属蛋白酶抑制剂1可导致肝脏趋化因子配体12水平升高，促进中性粒细胞向肝脏募集，从而促进肝转移的发生[42]。因此，抑制趋化因子配体12依赖性中性粒细胞募集和中性粒细胞全身耗竭均能抑制组织金属蛋白酶抑制剂1诱导的肝转移易感性[43]。

3 TANs作为肿瘤治疗的潜在目标

虽然TANs及其产生的细胞因子在CRC的发生发展中起重要作用，但具体机制尚不完全清楚，TANs作为潜在治疗靶点的评估仍在进行中。考虑到TANs在肿瘤发展中的作用，靶向中性粒细胞可能成为一种潜在的新的抗肿瘤方法。一些“耗竭”循环中性粒细胞的化疗手段，虽然减少了肿瘤微环境中的中性粒细胞,但也会增加机会性感染的发生率。而阻断中性粒细胞，特别是TANs的特定群体，可促进肿瘤消退或减少转移扩散。

转化生长因子-β作为肿瘤微环境的组分之一，可调节中性粒细胞的促肿瘤和抗肿瘤表型，因此转化生长因子-β阻断在理论上是一种潜在的治疗策略。然而，由于转化生长因子-β参与了许多生理过程，导致测试转化生长因子-β阻断作用的试验因显著的不良反应而失败[44]。针对转化生长因子-β或其受体的新策略目前正在临床试验中。

中性粒细胞是最丰富的白细胞，在免疫应答期间被招募到感染部位，中性粒细胞颗粒中的酶可使吞噬溶酶体的pH值发生变化，并通过呼吸爆发释放活性氧类进而杀灭病原体[45]。然而，中性粒细胞释放的活性氧类可导致DNA碱基损伤以及突变，这些突变对细胞癌变、细胞增殖、癌性炎症、免疫抑制等至关重要，如过氧化氢之类的活性氧类也可以作为细胞信号转导的信使，调节细胞信号通路(如促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶1/2通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、核因子κB通路)在肿瘤中的作用，TANs还可通过生成过氧化氢抑制肺转移[46]。癌症的进展需要肿瘤微环境中活性氧类达到一定水平[47]。中性粒细胞释放活性氧类可被认为是肿瘤患者潜在的治疗靶点。

趋化因子阻断可能是抑制中性粒细胞向肿瘤募集的另一有效策略。CRC细胞分泌的趋化因子8会招募中性粒细胞[33-34,37]，通过中和抗体阻断趋化因子8受体-配体轴可能是一种很好的治疗方法。然而，这种方法对人类肿瘤循环或肿瘤内中性粒细胞表型的影响尚不清楚。因此，需要进一步研究以获得对TANs和CRC的详细了解，以利于未来新的抗肿瘤治疗的应用。

4 小 结

中性粒细胞作为人体循环免疫中最丰富的白细胞，在机体免疫、防御等方面占重要地位。但癌症患者术后循环NLR增高可对患者产生不良影响。在CRC患者中，浸润CRC组织的TANs受周围组织信号影响，表现出抗肿瘤性N1表型或促肿瘤性N2表型的可塑性，分化为促进肿瘤表型可对CRC患者的远期生存产生不利影响。对中性粒细胞的研究有助于了解肿瘤微环境，寻找调节中性粒细胞分化的相关细胞因子，了解细胞因子在不同通路的作用，进而寻找抑制肿瘤发生发展的方法及药物。因此，对中性粒细胞的研究有助于寻找新的特异性治疗靶点和生物标志物。