尚 雪, 罗 阳

(1. 辽宁省金秋医院 口腔科, 辽宁 沈阳, 110000; 2. 中国医科大学附属盛京医院, 辽宁 沈阳, 110000)

牙周炎是临床上常见的一种以牙周膜结缔组织破坏和牙槽骨吸收为特征的慢性炎症，常由宿主免疫反应和微生物感染引起。牙周炎的发生、发展与多种因素密切相关，包括年龄、性别和是否吸烟[1-2]。Qandil R[3]研究发现，吸烟是增加牙周探诊深度的独立危险因素，会影响牙周血液循环，进而导致龈下微生物菌群发生改变，龈沟液中多种细胞因子增加，最终造成牙周纤维结缔组织破坏[4-6]。肝细胞生长因子(HGF)主要由间充质细胞合成，并在炎症反应中由单核细胞大量表达。Kakimoto 等[7]研究发现，牙龈组织中的炎性细胞HGF表达量高，并认为在牙周袋的形成以及牙槽骨吸收的病理发展过程中HGF起到重要的调控作用。但关于HGF与慢性牙周炎炎症程度的关系目前研究尚少。吸烟是牙周疾病产生及发展的主要诱发因素之一，研究[8-9]认为其可能会引起牙周局部的小血管收缩，进而影响体液和细胞免疫诱导炎症反应。本研究观察HGF在轻中重度慢性牙周炎牙龈组织中的表达水平以及与吸烟的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年8月—2019年8月辽宁省金秋医院口腔内科就诊的慢性牙周炎患者110例作为慢性牙周炎组，其中轻中度者75例为轻中度慢性牙周炎组，平均年龄(46.24±6.29) 岁，重度35例为重度慢性牙周炎组，平均年龄(48.24±6.11) 岁; 不吸烟者55例，平均年龄(45.32±5.62) 岁，吸烟者55例，平均年龄(48.38±6.03) 岁。同时选取因第三磨牙阻生而拔除且牙周组织健康者110例作为对照组，其中不吸烟者84例，平均年龄(27.98±3.21) 岁; 吸烟者26例，平均年龄(24.67±4.32) 岁。所有吸烟者的吸烟年限为2～32年。纳入标准: ① 近3个月内无牙周病治疗史及抗生素用药史且无感染及其他全身性疾病; ② 牙周健康者的牙周组织无炎症; ③ 慢性牙周炎组患者纳入标准根据按美国牙周病协会(APP) 1999年制定的牙周炎分类标准[14], 并根据附着丧失(CAL) 将牙周炎分为轻中度(CAL≤3～5 mm)、重度(CAL>5 mm); ④ 所有参与患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实验标本制备: 术前告知所有研究对象手术的具体取样情况并签署知情同意书。慢性牙周炎组于牙周翻瓣术中切取其牙龈组织; 对照组在拔除阻生牙时切取其健康牙龈组织。牙龈组织取到后立即进行磷酸缓冲盐溶液(PBS) 冲洗3次，放入无酶EP管中，并置于液氮中保存备用。

1.2.2 采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测HGF mRNA表达水平: 将牙龈组织样本在液氮冷冻下充分研磨，加Trizol 裂解液进行细胞裂解，按照Trizol试剂盒说明书方法提取总RNA; 经紫外分光光度计检测确定其OD260/280在1.8～2.0后，用逆转录试剂盒合成cDNA。然后以cDNA为模板, β-actin为内参抗体，用7500 RT-PCR仪进行PCR扩增。总反应体系20.0 μL, 分别为SyB 10.0 μL、RoX 0.4 μL、cDNA 2.0 μL, 上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.8 μL, 双蒸水(ddH2O) 6.0 μL。反应条件: 95 ℃, 30 s; 95 ℃, 5 s; 60 ℃, 34 s (40个循环)+读板，每个样本设置3个平行孔。反应结束后，根据各样本目的基因和内参基因的反应CT值，采用2-△△CT法计算各样本中HGF mRNA的相对表达量。各引物序列如下: HGF上游引物, 5′-TAAGAAGAGCACTGAGAGGTGGAA -3′, 下游引物: 5′-AATATCAGAGAGGTGGAA-3′, 产物长度180 bp。β-actin上游引物: 5′ -GAGCTACGAGCTGCCTGA CG-3′, 下游引物: 5′ -GTAGTTTCGTGGATGCCACAG -3′, 产物长度120 bp。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用方差分析及LSD检验对各组吸烟者和不吸烟者的HGF mRNA表达水平进行比较。检验水准为α= 0.05。

2 结 果

2.1 2组牙龈组织中HGF mRNA表达水平比较

RT-PCR 检测结果显示，慢性牙周炎组牙龈组织中HGF mRNA的表达水平为(2.17±0.09), 显著高于对照组的(1.04±0.07) (P<0.05)。

2.2 轻中重度慢性牙周炎患者牙龈组织中

HGF mRNA表达水平比较

轻中度、重度慢性牙周炎组牙龈组织中HGF mRNA的表达水平分别(1.71±0.08)、(3.00±0.09), 均显著高于对照组的(1.04±0.07)(P<0.05); 且重度慢性牙周炎组牙龈组织中HGF mRNA的表达水平显著高于轻中度慢性牙周炎组(P<0.05)。

2.3 吸烟对慢性牙周炎组及对照组牙龈组织中

HGF mRNA表达水平的影响

对照组和慢性牙周炎组中，牙龈组织中HGF mRNA的平均表达水平为吸烟者高于不吸烟者，其中以慢性牙周炎组中吸烟者的HGF mRNA表达水平最高，其表达水平由高到低依次为: 慢性牙周炎组吸烟者(3.03±0.15)>慢性牙周炎组不吸烟者(2.36±0.17)>对照组吸烟者(1.18±0.01)>对照组不吸烟者(1.00±0.07); 对照组吸烟者与对照组不吸烟者HGF mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05), 其他各组两两比较差异均有统计学意义(P<0.05) 。

3 讨 论

HGF最早是从鼠的部分肝脏血清中分离出来的，之后又在鼠的血小板、肝细胞和人的血液中提取出来，是一种具有生物活性的生长因子。研究[15-18]发现，其在眼部组织中可由多种细胞产生，刺激眼内多种其它细胞的生长和移行。在肌腱成纤维细胞中HGF依赖AMPK信号通路抑制肌纤维母细胞分化。研究[19]显示, HGF在牙周炎患者的牙龈组织和牙周膜中存在过量表达。经牙周基础治疗后，患者龈沟液中HGF水平可明显下降。

本研究通过RT-PCR技术对慢性牙周炎组和健康牙龈组织中HGF mRNA的表达水平进行检测，发现慢性牙周炎组中HGF mRNA的表达量明显显著高于健康牙龈组织，差异有统计学意义。说明HGF在慢性牙周炎的发生发展中起着一定的作用。在重度慢性牙周炎患者中，牙龈组织中HGF mRNA的表达水平显著高于轻中度患者(P<0.05), 表明随着牙周炎症的加重，其牙龈组织中HGF mRNA的表达水平也相应升高。本研究还发现，无论是对照组还是慢性牙周炎组，其牙龈组织中HGF mRNA的表达水平均为吸烟者高于不吸烟者，且以慢性牙周炎组吸烟者HGF mRNA的表达水平最高。该结果证实吸烟可导致牙龈组织中HGF mRNA的表达水平升高，并可能会加重牙周炎症。

综上所述, HGF mRNA在慢性牙周炎患者牙龈组织中高表达，且与慢性牙周炎患者严重程度呈正相关，且吸烟患者中HGF的mRNA表达水平也高于非吸烟患者，提示吸烟可能通过上调HGF来诱发慢性牙周炎以及参与调控其疾病的进展过程，可作为标志物来诊断疾病。